پديد آورنده :
ملك زاده ،رحيم
عنوان :
توليد نوتركيب ناحيه غني از سيستئين انتهاي كربوكسي متالوتيونين تيپ 1 برنج (OsMTI-1b) و بررسي قابليت اتصال آن به فلز كادميوم
مقطع تحصيلي :
كارشناسي ارشد
گرايش تحصيلي :
بيوتكنولوژي
محل تحصيل :
اصفهان: دانشگاه صنعتي اصفهان، دانشكده كشاورزي
صفحه شمار :
هفده، 130ص.: مصور، جدول، نمودار
يادداشت :
ص.ع. به فارسي و انگليسي
استاد راهنما :
آذر شاه پيري
تاريخ نمايه سازي :
94/2/22
استاد داور :
مجيد طالبي، آقافخر ميرلوحي
تاريخ ورود اطلاعات :
1396/09/27
چكيده فارسي :
چكيده متالوتيونينها MT گروهي از پروتئينهاي غني از آمينواسيدهاي سيستئين و با وزن مولكولي كم 5 تا 19 كيلودالتون هستندكه ميتوانند از طريق گروه تيول آمينواسيدهاي سيستئن به فلزات متصل شوند بيشتر مطالعات بر روي متالوتيونينها در گياهان به بررسي بيان اين ژنها در بافت هاي مختلف محدود شده است و تحقيقات اندكي تاكنون بر روي نقش و ساختار متالوتيونينها صورت گرفته است تحقيق حاضر با هدف حذف انتهاي آميني از ايزوفرم OsMTI 1b متعلق به تيپ 1 P متالوتيونين برنج و توليد فرم موتاسيون يافته C OsMTI 1b و بررسي نقش آن در ايجاد تحمل به تنش فلزات كادميوم نيكل روي و مس در مقايسه با فرم طبيعي آن OsMTI 1b انجام شد به منظور توليد قطعه ژني C OsMTI 1b از ژن OsMTI 1b پرايمراختصاصي طراحي و ژن مورد نظر توسط PCR تكثير و در ناقل بياني pET41a همسانهسازي گرديد پس از تائيد صحت همسانهسازي با استفاده از توالي يابي دستواره توليد شده به ميزبان بياني E coli سويهي 3 Rosetta DE منتقل شد با القا بيان پروتئين توسط IPTG ميزان قابل توجهي از پروتئين GST C OsMTI 1b توليد شد تحمل سويههاي بيان كنندهي پروتئينهاي GST OsMTI 1b GST N OsMTI 1b و GST C OsMTI 1b به فلزات سنگين كادميوم و نيكل و فلزات ضروري روي و مس از طريق ترسيم منحني رشد باكتريها در حضور نمكهاي ZnSO4 7H2O NiCl2 6H2O CdCl2 H2O و 4 CuSO تعيين شد همچنين اندازهگيري ميزان كاهش فلز كادميوم از محيط كشت با استفاده از دستگاه طيف سنجي جذب اتمي AAS بررسي شد با خالصسازي پروتئين نوتركيب امكان بررسي تمايل و ظرفيت اتصال آن به فلزات كادميوم نيكل روي و مس در مقايسه با فرم GST OsMTI 1b و GST N OsMTI 1b فراهم گرديد به اين منظور از روشهاي مختلف شامل بررسي تغيير در الگوي جذب نور و همچنين واكنش با معرف لمن استفاده گرديد نتايج حاصل از بررسي منحني رشد سويهي موتاسيون يافته به فلزات نشان ا داد كه بيان پروتئين GST C OsMTI 1b موجب افزايش تحمل سلولهاي باكتري به فلزات كادميوم نيكل روي و مس مي شود اندازه گيري ميزان فلز كاهش يافته از محيط كشت توسط طيف سنجي جذب اتمي نشان داد سويهي موتاسيون يافته قادر است 4 63 ppm از فلز كادميوم را در محيط كشت جذب كند كه اين ميزان براي سويه بيان كننده پروتئين كامل GST OsMTI 1b و GST N OsMTI 1b به ترتيب 4 13 ppm و 44 2 بود مقايسه مقدار فلز جذب شده در اين سويهها نشان داد كه ميزان جذب فلز در سويه بيان كننده پروتئين GST C OsMTI 1b تقريب ا برابر با سويه بيان كننده پروتئين GST OsMTI 1b ميباشد اين امر ميتواند به دليل ايجاد ساختار فشردهتر حاصل از حذف انتهاي آميني باشد براي بررسي واكنش المن با پروتئينهايي كه به صورت مستقيم در معرض فلز قرار گرفته بودند ابتدا فرم عاري از فلز آپو پروتئين آنها با استفاده از روش اسيدي كردن توليد و سپس در معرض غلظت اشباع از يونهاي كادميوم نيكل و روي قرار گرفتند نتايج نشان داد كه سرعت اوليه واكنش معرف المن با پروتئين در فرم بدون فلز بيشتر از پروتئينهاي حاوي كادميوم نيكل و روي بود كه اين موضوع بيانگر جذب اين فلزات توسط پروتئين ميباشد همچنين بررسي تغيير در الگوي جذب نور پروتئين موتاسيون يافته نتايج جذب كادميوم نيكل روي و مس را توسط اين پروتئين تائيد كرد به طور كلي نتايج بدست آمده فعاليت پروتئين موتاسيون يافته را در جذب فلز حتي بدون انتهايي آميني تأييد ميكند كه اين موضوع بيانگر قابليت اتصال انتهاي كربوكسي غني از سيستئين OsMTI 1b به طور مستقل از انتهاي آميني به فلز ميباشد واژگان كليدي برنج متالوتيونين ناحيه غني از سيستئين انتهايي قابليت اتصال
چكيده انگليسي :
Assessment of Cadmium Binding Ability of C terminal Cysteine rich Region of Rice Metallothionein Type 1 OsMTI 1b by Deletion of N terminal Cystein rich Region Rahim Malekzadeh malekzadeh rm@gmail com r malekzadeh@ag iut ac ir December 31 2014 Department of Agricultural Biotechonolgy Isfahan University of Technology Isfahan 84156 83111 IranDegree M Sc Language FarsiA Shahpiri Assist Professor a shahpiri@cc iut ac irAbstractMetallothioneins MTs are a Cys rich protein with low molecular wight 5 10 KDa that can bind heavy metalsvia the thiol groups of Cys residues More studies on plant MTs has been limited on gene expression analysis invarious tissues So far a little researches on role and structure of MTs has been done The aim of this study waselimination the amino terminal from OsMTI 1b isoform belonging to type P1 rice MT and production of mutantform of C OsMTI 1b and investigation of effect of that on tolerance of cadmium nickel zinc and copper stresscompared to its wild type OsMTI 1b For production C OsMTI 1b gene fragment from OsMTI 1b gene specificprimer was designed and C OsMTI 1b gene was amplified by PCR The Amplified fragment was cloned inpET41a expression vector The Colony was confirmed by sequencing and then the producing construct wastransferred into expression host Escherichia coli strain Rosetta DE3 By inducing of protein production byIsopropyl D thiogalactopyranoside IPTG the considerable amount of GST C OsMTI 1b protein produced The tolerance of strains producing GST OsMTI 1b GST N OsMTI 1b and GST C OsMTI 1b protein to heavymetals were investigated by plotting their growth curve in presence of CdCl2 H2O NiCl2 6H2O ZnSO4 7H2Oand CuSO4 salts and by measurement of the amount of decreased of cadmium in culture medium by using atomicadsorption spectroscopy AAS Recombinants proteins were purified and the metal binding ability of GST C OsMTI 1b protein was compared to its wild form GST OsMTI 1b and GST N OsMTI form Comparison ofmetal binding ability was performed by investigation of spectroscopic characteristics and reaction with Ellman sreagent The results of growth curve of mutated strain to metals showed that the tolerance of bacteria cells to Cd Ni Zn and Cu increased due to the expression of GST C OsMTI 1b protein The measurement of amount ofdecreased cadmium metal from culture medium using atomic adsorption spectroscopy showed that the mutatedstrain can absorb 4 63 ppm of Cd from culture medium Amount of absorbed Cd in the producing GST OsMTI 1b and GST N OsMTI 1b proteins were 4 93 and 2 44 ppm respectively Comparisons of amount of absorbedmetal on these strains have shown that the metal absorption capacity in strain producing GST C OsMTI 1bprotein Due to more compact structure of this mutant its near to strain producing GST OsMTI 1b protein Investigation of binding capability of GST C OsMTI 1b protein to Cd Ni and Zn in in vitro condition wereperformed by reaction of mutated protein with Ellman s reagent So Apo proteins were prepared by acidificationmethod and then these proteins were exposed to to saturated concentrations of Cd Ni and Zn ions The resultsshowed that the initial rate of reaction of Ellman s reagent with apo GST C OsMTI 1b protein was more thanprotein containing Cd Ni and Zn These results showed that the GST C OsMTI 1b protein can absorb thesemetals Also study on spectroscopic characteristics of mutant protein confirmed results of absorption of Cd Ni Zn and Cu by this protein Generally the results showed that the mutated protein even without of amino terminalcan bind to metal These results suggest that the C terminal Cys rich region in of OsMTI 1b can bind metalsindependent of N terminal Keywords Rice Metallothionein terminal Cys rich region binding ability
استاد راهنما :
آذر شاه پيري
استاد داور :
مجيد طالبي، آقافخر ميرلوحي
