پديد آورنده :
اكبرزاده، حميد
عنوان :
شناسايي برخي از ژن هاي دخيل در مسير سنتز B - Sitosterol در گياه انار﴿Punica granatum﴾
مقطع تحصيلي :
كارشناسي ارشد
گرايش تحصيلي :
بيوتكنولوژي كشاورزي
محل تحصيل :
اصفهان: دانشگاه صنعتي اصفهان، دانشكده كشاورزي
صفحه شمار :
هفده،138ص.: مصور
استاد راهنما :
مجيد طالبي
استاد مشاور :
بدرالدين ابراهيم سيد طباطبايي
توصيفگر ها :
فيتوسترول , RACE - PCR , qPCR
تاريخ نمايه سازي :
1394/11/03
استاد داور :
مسعود بهار، مهدي رحيم ملك
چكيده فارسي :
چکیده فیتوسترولها شامل استرولهای گیاهی و استانول ها ترکیبا ت استروئیدی با ساختار شیمیایی و عملکردهای بیولوژیکی شبیه به کلسترول میباشند فیتوسترولها از طریق یک یا چند مکانیسم رقابتی جایگزین کلسترول در میسلهای تشکیل شده در مجرای روده شده و باعث کاهش سطح کلسترول خون میشوند در بین استرولهای گیاهی Sitosterol شایعترین فیتوسترول است و به طور گستردهای در قلمرو گیاهان توزیع شده است مطالعا ت داروشناسی نشان داده که sitosterol دارای خواص ایمنی میکروبی و دارویی فراوانی است و در فرآیندهای بیولوژیک موجودا ت زنده نقش بسزایی ایفا میکند گیاه انار از دیر باز به عنوان یک منبع غذایی مفید با خواص درمانی فراوان شناخته شده است ترکیبا ت Sitosterol از برخی از بافتهای گیاه انار جداسازی و شناسایی شدهاند ولی ژنهای دخیل در مسیر بیوسنتز آنها در این گیاه شناسایی نشده است به منظور شناسایی پنج ژن انتهایی مسیر سنتز Sitosterol طراحی آغازگر از نواحی حفاظت شده توالیهای مشابه که در گیاهان دیگر شناسایی شده بودند انجام پذیرفت سپس محتوی اسید نوکلئیک DNA و RNA پنج بافت مختلف ساقه برگ گل دانه و پوست از سه ژنوتیپ گیاه انار به روش مبتنی بر CTAB استخراج شد عملکرد آغازگرها روی مولکول DNA بررسی شد آغازگرهای طراحی شده د ارای نواحی چند نوکلوتید مخلوط بودند به همین دلیل تمایلشان برای تکثیر قطعه مورد نظر بسیار پایین بود و قطعا ت غیراختصاصی زیادی همراه با قطعه مورد نظر تکثیر نمودند سپس برای تکثیر نواحی اگزون ژنهای مورد نظر واکنش PCR با آغازگرهای فوق روی مولکول cDNA انجامگ رفت در این واکنش قطعا ت هدف بدون باندهای غیراختصاصی تکثیر شدند که این امر نمایانگر عدم بیان قطعا ت غیراختصاصی تکثیر شده میباشد قطعا ت تکثیر شده در این مرحله در پالسمید pTZ57R T همسانه سازی و سپس به باکتری E coli سویه 1601 MC منتقل شدند پالسمیدهای نوترکیب برای توالی یابی ارسال شدند پس از همردیف سازی توالیهای خوانش شده در پایگاه داده NCBI مشابهت توالیهای شناسایی شده با توالی های مشابه در پایگاه داده تایید گردید سپس شناسایی توالی کامل نواحی اگزون ژنهای DEH ALP و MET که به ترتیب فرآیندهای متیالسیون اکسیداسیون و احیا را سنتز میکنند طی فرآیند RACE PCR و با استفاده از نواحی ناقص شناسایی شده در مراحل قبلی انجامگرفت پس از جداسازی قطعا ت مورد نظر از توالیهای خوانش شده توالیهای 3 و 5 و قطعا ت ناقص شناسایی شده در مرحله قبل کنار هم قرارداده شدند و توالی کامل ژن با شناسایی نواحی ORF و UTR مشخص شد ژن ALP به طول 1311 bp و ناحیه ORF آن 810 bp ژن DEH به طول 1834 bp و ناحیه ORF آن 1212 bp و ژن MET به طول 1495 bp و ناحیه ORF آن 1278 bp بدست آمد همردیف سازی توالیها در پایگاه داده NCBI توسط Blastx Blastn و Blastp انجام شد و مشابهت توالیهای شناسایی شده با توالی های مشابه در پایگاه داده تایید شد توالیهای پروتئینی مربوط به نواحی ORF ژنهای شناسایی شده توسط پایگاههای EMBL EBI و بخش ExPASy InterPro PSIPRED و SWISS MODEL مورد مطالعه قرارگرفتند و صحت شناسایی توالیهای مربوط به ژنهای سنتز کننده مسیر بیوشیمیایی Sitosterol را تاییدکردند به منظور بررسی بیان سه ژن فوق واکنش qPCR روی 51 مولکول cDNA متعلق به پنج بافت مختلف از سه ژنوتیپ گیاه انار به همراه سه ژن کنترل داخلی 9 18S rps و ef1 جهت نرمال سازی دادهها در کمیت سنجی نسبی انجام گرفت نتایج مطالعه بیان ژن نشان داد که تقریبا در تمامی بافتها و ژنوتیپها باالترین بیان مربوط به ژن DEH میباشد و پایینترین بیان مربوط به ژن MET بود در بین بافتهای مختلف گیاه انار بافت دانه بیشترین بیان را برای هر سه ژن نشان داد ژن DEH یکی از آنزیمهای انتهایی مسیر سنتز Sitosterol را کد میکند و بیان باالتر آن نسبت به دو ژن دیگر مبین تمایل باالی گیاه به سنتز Sitosterol از تمامی محتوی پیش ماده تولیدی توسط آنزیمهای قبلی است شناسایی پنج ژن انتهایی مسیر سنتز Sitosterol وجود این مسیر بیوشیمیایی را در گیاه انار نشان میدهد بیان باالتر ژنهای انتهای مسیر در بافت پوست و دانه میوه انار نشان دهنده سنتز باالتر این ترکیبا ت بویژه در بخش های خوراکی این گیاه است که اهمیت انار را به عنوان یک غذای سالمت نشان میدهد کلمات کلیدی انار فیتوسترول qPCR RACE PCR Sitosterol
چكيده انگليسي :
Identification of some Genes Involved in the Synthesis of Sitosterol in Pomegranate Punica granatum Hamid Akbarzadeh akb hamid@yahoo com Decembre 22 2015 Department of Biotechnology Isfahan University of Technology Isfahan 84156 83111 Iran Degree M S Language Farsi Supervisor M Talebi mtalebi@cc iut ac ir Abstract Phytosterols including plant sterols and stanols are steroid compounds with chemical structure and biological function similar to cholesterol Phytosterols replace cholesterol in the micelles which are formed in the intestinal tract and reduce blood cholesterol levels through one or more mechanisms of competitive Among the phytosterols Sitosterol is the most common and widely distributed in the plant kingdom Pharmacology studies have shown that sitosterol has many immunological microbial and pharmaceutical properties and plays a significant role in the biological processes of living organisms Pomegranate has long been known as a useful food source with many health benefits sitosterol compounds were isolated and identified in some of the pomegranate plant tissues but the genes involved in this pathway have not been identified In order to identify five terminal genes in Sitosterol pathway primers designed according to the conserved regions of similar sequences in other plants Nucleic acids DNA and RNA were extracted from five different tissues stems leaves flowers seeds and skin of three pomegranate cultivars using CTAB based method Degenerative primers tested in genomic DNA amplified non specific bands cDNA amplification produced specific bands which represented that the non specific fragments were non coding Amplified fragments were cloned in the pTZ57R T plasmid and transferred to E coli strain MC1061 The recombinant plasmids were sequenced and NCBI nucleotide blast Blastn identified similar sequences in the database and confirmed the sequences Full sequences of ALP DEH and MET genes involved in methylation oxidation and reduction processes respectively were identified using RACE PCR reaction Sequences of 3 and 5 ends and partial fragments of these genes were assembled and ORF and UTR regions characterized The full length of ALP DEH and MET genes were 1311 1834 and 1495 bp with the ORF regions of 810 1212 and 1278 bp respectively Blastn Blastx and Blastp verified the sequences Analysis of translated protein sequences related to ORF regions using InterPro of EMBL EBI ExPASy PSIPRED and SWISS MODEL confirmed the sequences of genes related to the synthesis of Sitosterol Expression of three full sequenced genes in five different tissues and three cultivars of pomegranate were performed using qPCR reaction Three internal control genes including rps9 18S and ef1 were used in relative quantification method for data normalization The highest and lowest expression in all tissues and cultivars were related to DEH and MET genes respectively Among the tissues the seed showed the highest level of expression for all three genes DEH gene is the last enzyme in sitosterol pathway and its higher expression leads to higher propensity of plant to the synthesis of Sitosterol from all precursors Identification of five genes associated with the end of Sitosterol synthesis pathway suggests that pomegranate synthetizes Sitosterol High expression of studied genes in peel and seed of the fruit represents the high synthesis of Sitosterol compounds especially in edible parts of the plant that shows the importance of the pomegranate as a healthy food Keywords Pomegranate Phytosterol Sitosterol RACE PCR qPCR
استاد راهنما :
مجيد طالبي
استاد مشاور :
بدرالدين ابراهيم سيد طباطبايي
استاد داور :
مسعود بهار، مهدي رحيم ملك
