12053

11042

كارشناسي ارشد

بيوتكنولوژي

اصفهان: دانشگاه صنعتي اصفهان، دانشكده كشاورزي

1395

هفده، 123ص.: مصور، جدول، نمودار

ص. ع. به فارسي و انگليسي

آذر شاه پيري

علي اصغر كارخانه

بدرالدين سيد طباطبايي، جهانگير خواجه علي

1395/11/10

كتابنامه

كشاورزي

مهندسي كشاورزي

ID11042

1 چكيده آنزيم استوهيدروكسي اسيد سنتاز 6 1 2 2 EC اولين مرحله در مسير بيوسنتز اسيد آمينههاي شاخه دار را كاتاليز ميكند اين آنزيم با اتصال دو مولكول پيروات استوالكتات را ميسازد كه پيش ساز دو اسيدآمينهي والين و لوسين ميباشد همچنين با اتصال يك مولكول پيروات و يك مولكول2 كتو بوتيرات منجر به توليد 2 استو2 هيدروكسي بوتيرات ميشود كه پيش ساز اسيدآمينهي ايزولوسين ميباشد اين آنزيم مورد هدف علف كشهاي بازدارنده AHAS از جمله سولفونيل اورهها قرار ميگيرد كه فعاليت آنزيم را مهار ميكنند آنزيم كامل AHAS شامل زير واحد كاتاليزگر و زيرواحد تنظيمي ميباشد در اين مطالعه ژن كدكننده زيرواحد كاتاليزگر آنزيم AHAS از گياه برنج Oryza Sativa با يك قسمت كوتاه از توالي ترانزيت پپتيد كلروپالستي در پالسميد pET41a همسانه سازي شد پالسميد نوتركيب حاصل به ميزبان بياني Escherichia coli سويه 3 Rosetta DE منتقل و بيان GST OsAHAS با افزودن IPTG القا شد به منظور افزايش حالليت پروتئين نوتركيب در سيستم بياني پروكاريوتي برخي از شرايط بياني رشد باكتري بهينه شدند پروتئين نوتركيب با روش كروماتوگرافي تمايلي و با استفاده از ستونهاي His trap HP خالص سازي گرديد فعاليت آنزيمي پروتئين نوتركيب خالص شده در حضور پيش ماده و كوفاكتورهاي مورد نياز خود با روش رنگ سنجي اندازه گيري و سپس تمامي اجزا و شرايط واكنش براي فعاليت حداكثري آنزيم بهينه شدند فعاليت آنزيمي به صورت جداگانه در حضور سه اسيد آمينه شاخه دار و همچنين در حضور 5 علف كش مهار كننده AHAS از خانواده سولفونيل اوره ها مورد سنجش قرار گرفت پروتئين خالص به صورت يك باند با سايزي در حدود 89 كيلو دالتون بر روي ژل SDS PAGE مشاهده شد كه وزن مولكولي پيش بيني شده براي پروتئين نوتركيب را تاييد ميكند غلظت پروتئين نوتركيب تحت شرايط آزمايش شده كه شامل غلظت 1 0 ميلي موالر القاكننده استفاده از محيط كشت TB كاهش دماي رشد باكتري تا 28 C و افزايش زمان بيان تا 6 ساعت بود به صورت موفقيت آميزي تا مقدار 627 ميكروگرم بر ميلي ليتر افزايش يافت غلظتهاي بهينه در واكنش آنزيمي AHAS براي پيش ماده FAD ThDP و 2 MgCl برابر با 05 ميلي موالر 2 ميلي موالر 01 ميكروموالر و 01 ميلي موالر بدست آمد همچنين آنزيم در دماي 37 C و در pH برابر 8 باالترين ميزان فعاليت را داشت با در نظرگرفتن تمامي شرايط بهينه فعاليت آنزيم برابر با 0 065 mol min mg اندازه گيري شد اين فعاليت آنزيمي در حضور سه اسيدآمينهي والين لوسين و ايزولوسين به طور متوسط تا 01 كاهش يافت كه مهم ترين علت آن را مي توان به نبود زيرواحد تنظيمي براي ايفاي نقش خود در بازخورد مهاري مرتبط دانست نتايج ارزيابي فعاليت آنزيم در حضور علف كشها نشان داد كه مقدار 05 I براي علف كش هاي تري بنورون سولفوسولفورن نيكو سولفورن و بن سولفورن به ترتيب برابر با 05 06 05و 021 نانوموالر بود همچنين علف كش ريم سولفورن واكنش آنزيمي را مهار نكرد طبق نتايج اين تحقيق علف كش بن سولفورن با باالترين غلظت در مهار AHAS گياه برنج ميتواند به عنوان علف كشي با كمترين تاثير بر روي AHAS گياه برنج براي از بين بردن علف هاي هرز اين گياه زراعي قابل توصيه باشد اين علف كش در شرايط طبيعي مزرعه نيز به عنوان يكي از علف كشهاي مورد استفاده در مزارع برنج شناخته ميشود كه ميتواند تاييدي بر نتايج اين تحقيق باشد كلمات كليدي استوهيدروكسي اسيد سنتاز Oryza Sativa اسيدآمينههاي شاخه دار علف كشهاي مهار كننده AHAS

125 Cloning and Heterologous Expression of Catalytic Subunit of Rice Oryza Sativa Acetohydroxy Acid Synthase in Escherichia coli Ghazaleh Arabzadeh g arabzadeh@ag iut ac ir December 25 2016 Department of Agricultural Biotechnology Isfahan University of Technology Isfahan 84156 83111 IranDegree M Sc Language FarsiSupervisor A Shahpiri a shahpiri@cc iut ac irAbstractAcetohydroxyacid synthase AHAS EC 2 2 1 6 is the first enzyme in the biosynthetic pathway of the branchedchain amino acids The function of AHAS is to catalyze the condensation of two molecules of pyruvate to formacetolactate the precursor of valine and leucine or one molecule of pyruvate with a molecule of 2 ketobutyrateto generate 2 aceto 2 hydroxybutyrate the precursor of isoleucine AHAS is the target enzyme for severalclasses of herbicides including sulfonylureas that inhibit the activity of this enzyme AHAS holoenzymes areassembled from catalytic subunits and regulatory subunits In the present work the gene encoding rice OryzaSativa AHAS catalytic subunit with a short part of the chloroplast transit sequence was cloned into pET41avector The resulting construct was transformed into Escherichia coli expression host strain Rosetta DE3 Following the induction with Isopropyl B d 1 thiogalactopyranoside the OsAHAS was expressed as carboxyl terminal extensions of glutathione S transferase GST tag a 6His tag and an S tag The expressedrecombinant fusion protein was named GST Os AHAS A large portion of expressed GST OsAHAS was foundin the insoluble fraction For enhancement of recombinant protein solubility in prokaryotic expression system widely used approaches include decrease of temperature and concentration of inducer and changing mediaculture was examined The soluble part of GST OsAHAS was purified using affinity chromatography using His Trap HP column The purified GST OsAHAS reaction was determine in the present of substrate and cofactorsand GST OsAHAS activity was measured by colorimetric assay Then all of reaction conditions includeconcentration of enzyme substrate cofactors and environmental conditions like temperature and pH wereoptimized The measurement of GST OsAHAS activity was performed under optimized conditions at present of3 branched chain amino acids and 5 sulfonylurea herbicides independently The purified enzyme was appearedas a single band on SDS PAGE with a molecular mass of about 98 KDa that is the same of molecular masspredicted from the cloned gene sequence The recombinant protein synthesis carried out in the 28 C 0 1 molarIPTG and in TB medium for 6h interestingly leading to increasing protein solubility up to 726 g ml Theoptimum concentration of substrate ThDP FAD and MgCl2 in GST OsAHAS reaction were 50mM 2mM 10 M and 10mM respectively Also the results showed that the optimum conditions for GST OsAHAS activitywere pH at 8 and temperature at 37 C AHAS activity by considering all of optimum conditions was achievedabout 0 065 mol min mg The purified GST OsAHAS activity was lost its sensitivity to end products valine leucine and isoleucine less than 10 inhibition and the possibility is that a second subunit which is responsiblefor the feedback sensitivity of ALS does not exist in these AHAS preparation The assessment of AHASactivity in the present of sulfunyurea herbicides demonstrate that I 50 value which is defined as the concentrationof inhibitors which inhibits AHAS activity 50 in an assay were 50 60 50and 120nM for Tribenuron Sulfosulfuron Nicosulfuron and Bensulfuron herbicides respectively and Rimsulfuron have no inhibitoryeffect on enzyme avtivity According to these results Bensulfuron has the highest I50 for inhibition of riceAHAS enzyme and would be advisable as a herbicide to inhibition of rice weeds for in vivo conditions in theother hand Bensulfuron is the most commonly used herbicide in the farms of rice and the results of ourexperiments emphasize that Bensulfuron which has the minimum inhibitory effect on rice AHAS can beintroduced as

آذر شاه پيري

علي اصغر كارخانه

بدرالدين سيد طباطبايي، جهانگير خواجه علي