پديد آورنده :
بابايي بندارتي، زهرا
عنوان :
بيان هترولوگ متالوتيونين گياه حرا (Avicennia marina) و بررسي قابليت اتصال آن به فلزات سنگين
مقطع تحصيلي :
كارشناسي ارشد
گرايش تحصيلي :
بيوتكنولوژي
محل تحصيل :
اصفهان: دانشگاه صنعتي اصفهان، دانشكده كشاورزي
صفحه شمار :
شانزده، ۱۰۹ص.: مصور، جدول، نمودار
استاد راهنما :
آذر شاه پيري
توصيفگر ها :
متالوتيونين , فلزات سنگين , راديكال هاي آزاد , متابوليسم فلزات
استاد داور :
عبدالرحيم مهرابي، مهدي رحيم ملك
تاريخ ورود اطلاعات :
1396/12/20
چكيده فارسي :
02 چكيده متالوتيونينها MT گروهي از پروتئينهاي غني از آمينواسيدهاي سيستئين با وزن ملكولي كم 5 تا 01 كيلودالتون هستند كه از طريق گروههاي تيول آمينواسيدهاي سيستئين عملكردهاي مختلفي از جمله سميتزدايي فلزاتسنگين تنظيمات متابوليسم فلزات و فعاليت پاكسازي راديكالهاي آزاد درسلول دارد گياه حرا Avicennia marina توانايي بااليي در جذب و ذخيره فلزات سنگين دارد با اين حال تا كنون اطالعات كمي در مورد پروتئين MT در اين گياه وجود دارد در تحقيق حاضر به بررسي نقش يكي از ايزوفرمهاي MT از گياه حرا 2 AmMT كه متعلق به تيپ 2 ژنهاي متالوتيونين ميباشد در تحمل سلولهاي باكتري به فلزات سنگين و تنشهاي اكسيداتيو پرداخته شد بدين منظور توالي ژن كدكننده 2 AmMT سنتز و در ناقل بياني pET41a همسانهسازي شد پس از تأييد صحت همسانهسازي با استفاده از توالييابي همسانههاي توليد شده به ميزبان بياني E Coli سويه 3 Rosetta DE منتقل شدند همچنين سويه شاهد با انتقال پالسميد فاقد ژن به سويه 3 Rosetta DE توليد شد با اضافهكردن ماده القاگر IPTG توليد اين پروتئين همراه با شريك الحاقي GST در فاز محلول تأييد شد تحمل باكتري بيان كننده پروتئين نوتركيب به فلزات سنگين از طريق ترسيم منحني رشد باكتري در حضور نمكهاي 4 NiCl2 CdCl2 ZnSO4 CuSO و 4 FeSo و همچنين اندازهگيري كاهش مقدار فلز از محيط كشت با استفاده از دستگاه طيف سنجي جذب اتمي AAS اندازهگيري شد نتايج حاصل از بررسي باكتري نوتركيب در تحمل به فلزات نشان داد كه بيان پروتئين 2 AmMT از طريق افزايش تجمع فلزات منجر به افزايش تحمل باكتري نسبت به فلزات روي كادميوم آهن و مس ميشود اما در مورد فلز نيكل افزايش تحمل مشاهده نشد سويه 2 R AmMT در محيط حاوي پراكسيد هيدروژن داراي تحمل باالتري نسبت به سويه شاهد بود در انطباق با اين نتيجه فعاليت كاتاالز در سويه 2 R AmMT بيشتر از سويه شاهد بود با استفاده از كروماتوگرافي تمايلي و همچنين فيلتراسيون ژلي مقدار قابل توجهي از پرئتئين خالص GST 2 AmMT به دست آمد با استفاده از pH اسيدي و حذف فلز با فيلتراسيون ژلي آپوپروتئين حاصل شد سپس آپوپروتئين در معرض مقادير اشباع از فلزات روي و آهن قرار داده شد با برگشت مجدد pH به 8 pH شرايط اتصال فلز به پروتئين فراهم شد سپس با استفاده از فيلتراسيون ژلي فلزهاي اتصال نيافته خارج شد توليد كمپلكس 2 Fe AmMT و 2 Zn AmMT با استفاده از پروفايل جذب و واكنش كمپلكس با DTNB تأييد شد اضافه كردن 2 Fe GST AmMT به پروتئين كل استخراج شده از باكتري E Coli باعث افزايش فعاليت كاتاالز شد همچنين با افزودن اين كمپلكس به پروتئين كل استخراج شده از گياه حرا افزايش فعاليت آنزيم آسكوربات پراكسيداز و آنزيم كاتاالز مشاهده شد اين در حالي بود كه افزودن فرم آپوي پروتئين هيچ تأثيري روي فعاليت اين آنزيمها نداشت به نظر ميرسد متالوتيونين با انتقال فلز آهن باعث افزايش فعاليت اين آنزيمها شده است بر اساس نتايج به دست آمده پروتئين 2 AmMT نه تنها در سميتزدايي فلزات نقش دارد بلكه با فراهم ساختن فلز براي متالوآنزيمهايي كه فعاليتشان وابسته به فلزات است باعث افزايش فعاليت آنها مي شود افزايش فعاليت متالوآنزيمهايي مانند آسكورباتپراكسيداز و كاتاالز منجر به افزايش تحمل سلول به پراكسيد هيدروژن مي شود كلمات كليدي متالوتيونين فلزات سنگين راديكال هاي آزاد متابوليسم فلزات
چكيده انگليسي :
110 Heterologous expression and metal binding characterization of gray mangrove Avicennia marina metallothionein Zahra Babaei Bendarti Babaeezahra93@gmail com 14 Januery 2018 Department of Agricultural Biotechonolgy Isfahan University of Technology Isfahan 84156 83111 IranDegree M Sc Language FarsiSupervisor A Shahpiri a shahpiri@cc iut ac irAbstractMetallothioneins MT are a group of Cys rich amino acid proteins with low molecular weight 5 10kDa that through the groups of thiol cysteine amino acids have a variety of functions including heavymetals detoxcification metal metabolism and free radical scavenging activity Avicennia marina has ahigh ability to absorb and accumulate heavy metals However there is little information about MT inthis plant In the present work the gene encoding AmMT2 as an type 2 from Avicennia marina wassynthesized and cloned in pET41a After induction with IPTG the protein AmMT was heterologouslyexpressed in Escherichia coli as carboxy terminal extensions of glutathione S transferase GST AmMT2 The tolerance of bacteria expressing GST AmMT2 to ZnSO4 CdCl2 CuSO4 NiCl2 andFeSO4 was compered to control by plotting their growth curve In addition the amount of metals thatwas removed from medium was determined using atomic absorption spectroscopy AAS The resultsshow that the strain R AmMT2 is able to remove Zinc copper cadmium iron and nickel from media In addition we found that the strain R AmMT2 had higher tolerance to hydrogen peroxide than controlstrain In agreement with this result the assay of catalase activity in R AmMT2 was higher than thatfrom control strain A significant amount of pure protein GST AmMT2 was producted using affinitychromatography and gel filtration The form of apoprotein was produced using acidic pH and removalof metals whit gel filtration Then apo form was exposed to saturated amounts of zinc and iron Themetal protein was provided by pH returning Then removed free metals by gel filtration However catalase and ascorbate peroxidase activity increased by adding Fe GST AmMT2 to total proteinextracted from E coli bacteria and total protein extracted from mangroves adding apo protein form didnot have any effect on the activity of these enzymes It seems that AmMT2 by exchanging iron metalincreased activity these enzymes Based on this results AmMT2 not only plays a role in thedetoxification of metals but also provides metal for metalloenzymes whose activity is metal dependent which increased their activity Increasing the activity of metalloenzymes such as ascorbate peroxidaseand catalase leads to increased cellular tolerance to hydrogen peroxide Key words Metallothionin Heavy metals Tolerance hydrogen peroxide
استاد راهنما :
آذر شاه پيري
استاد داور :
عبدالرحيم مهرابي، مهدي رحيم ملك
