15639

13985

كارشناسي ارشد

گياه پزشكي

اصفهان : دانشگاه صنعتي اصفهان

1399

پانزده ، 115 ص.: مصور (رنگي)، جدول

مسعود بهار

امير مساح

بهرام شريف نبي ، رحيم محرابي

1399/04/28

كتابنامه

كشاورزي

مهندسي كشاورزي

1399/04/28

2622039

چكيده بيماري پژمردگي لوبيا يكي از بيماريهاي مهم وخسارتزاي لوبيا است كه در سالهاي اخير از ايران گزارششدهاست نكروز بين رگبرگها سوختگي شاخ و برگ و پژمردگي بوته لوبيا بر اثر بستهشدن آوندهاي چوبي توسط عامل بيماري Curtobacterium flaccumfaciens pv flaccumfaciens Cff از مشخصات اصلي اين بيماري ميباشد نژادهاي مختلف Cff بذرزاد بوده و توانايي انتقال بيماري در محصول سال بعد مناطق جديد را دارند به دليل توليد و تجارت بذرلوبيا در اكثر مناطق كشور نمونهبرداري و رديابي Cff در بذرهاي آلوده براي كاهش خطر انتشار عامل بيمارگر از طريق بذر ضروري ميباشد به اين لحاظ در اين پژوهش رديابي جدايههاي Cff در بذرهاي تجاري لوبيا طول مدت ماندگاري آنها در محمولههاي بذري و ارائه يك روش معتبر براي رديابي مطمئن Cff در بذر مورد توجه قرارگرفت براي رديابي Cff در بذور لوبيا دانههاي لوبياهاي تغيير رنگ داده و چروكيده از مناطق مختلف ايران جمعآوري شد تعداد پنج دانه از هر نمونه در ۰۱ ميليليتر از بافر PBS به مدت۲۱ ساعت خيساندهشد و با بهمزدن ماليم درحدود ۰۰۱ تكانه در هر دقيقه در دماي آزمايشگاه نگهداريگرديد ازهر نمونه سوسپانسيوني يك لوپ روي محيط آگار مغذي يا محيطكشت نيمهانتخابي حاوي ۰۱ گرم پپتون يك گرم كازئين هيدروليزشده 5۲ ۰ گرم سولفاتمنيزيم با هفت مولكول آب ۸۱ گرم آگار ۰۱ گرم ليتيومكلرايد پنج گرم مالتوز و ۲5 g ml آنتيبيوتيك كلرامفينيكل در حجم يك ليتر آب به صورت خطي كشتگرديد پساز نگهداري محيطهايكشت در دماي ۸۲ به مدت دو روز كلنيهاي زرد با مورفولوژي متفاوت انتخاب و كشت خالصشد در بررسي اوليه تنوع ژنتيكي جدايههاي بهدستآمده طي انگشت نگاري ژنتيكي با استفاده از آغازگرهاي BOX IR و ERIC1R 2F تجزيه و تحليل شد اطالعات بهدستآمده از هر دو آزمون BOX و ERIC مشخصنمود كه جدايهها فارغ از منشا جغرافيايي خود تفاوت ژنتيكي بااليي دارند بر اساس دندروگرام ترسيمشده جدايهها در پنج گروه ۱۳ I جدايه ۱۴ II جدايه ۱6 III جدايه IV شش جدايه و V چهار جدايه خوشهبنديشدند ولي جدايه 45 BS با الگويباندي اختصاصي از بقيه جداماند براي شناسايي جنس باكتريهاي هر گروه انگشتنگاريشده ناحيه تقريبا كامل 16SrRNA هر جدايه انتخاب شده با استفاده از جفت آغازگر اختصاصي پروكاريوتي 27F 1492R تكثيرشد تعيينتوالي اين قطعه ۰۰5۱ نوكلئوتيدي جدايهها همرديفسازي و مقايسه آنها با ساير تواليهاي 16SRNA پروكاريوتي ذخيرهشده در GenBank نشانداد كه جدايههاي گروههاي II I و III با ۹۹ شباهت به جنسهاي باكتريايي Siccibacter sp Enterobacter sp و Kosakonia sp مربوطميشوندكه عموما به عنوان باكتريهاي اپيفيت شناختهميشوند اعضاي گروههاي شاخص IV و V به ترتيب با باكتريهاي C flaccumfaciens pv flaccumfaciens و Xanthomonas axonopodis pv phaseoli همولوژي بسيار زيادي ۲۷ ۹۹ داشتند جدايه 45 BS از بقيه اعضاي گروههاي ديگر متفاوتبود و بهدليل شباهت ۸۹ با Pantoea agglomerans بهعنوان جدايهاي از جنس Pantoea شناساييشد طي آزمايشات تفصيلي مورفولوژيكي فيزيولوژيكي بيوشيميايي و بيماريزايي بعدي اطمينان حاصلشد كه جدايههاي با كلني زرد گرم مثبت اكسيداز منفي گروه IV با توانايي بروز واكنشحساسيت روي برگهاي توتون قادرند عالئم پژمردگي را در گياه لوبيا ايجاد نمايند همچنين با استفاده از آغازگر اختصاصي 4 Cff FOR2 Cff REV يك قطعه 6۰۳ نوكلئوتيدي در تمام جدايههاي گروه IV تكثيرشد كه وابستگي اعضاي اين گروه به C flaccumfaciens pv flaccumfaciens را تأييد مينمايد جدايههاي Cff از بذور نمونهبرداريشده از استانهاي اصفهان و مركزي به لحاظ خصوصيات بيوشيميايي و مولكولي بسيار يكنواختبودند با توجه به طول مدت ماندگاري Cff در بذر لوبيا حداقل ۳۱ ماه طي پژوهش حاضر و اهميت ظرفيت باالي انتشار باكتري از طريق بذر لوبيا ضروري است كه يك روش آسان حساس و بدون نياز به كشت براي رديابي سريع باكتري Cff از بذر لوبيا ارائهشود تاكنون فقط يك دستورالعمل مبتنيبر PCR با استفاده از جفت آغازگر 4 Cff FOR2 Cff REV و توليد يك قطعه ۰6۳ نوكلئوتيدي براي شناسايي جدايههاي Cff معرفيشدهاست كه اندازه آن براي تعيين توالي جهت اعتباربخشي به نتايج كوتاه است براي دستيابي به يك روش جديد رديابي Cff در بذر لوبيا دوجفت آغازگر Cff1F Cff1R و Cff2F Cff2R برمبناي توالي ۰۰5۱ نوكلئوتيدي ناحيه 16SrRNA جدايه 50 Cff JSM طراحيشد نتايج بهينهسازي و ارزيابي رديابي اختصاصي Cff با اين جفت آغازگرهاي اختصاصي نشانداد كه Cff1F Cff1R و Cff2F Cff2R قادرهستند به ترتيب قطعات ۱۱۹ و ۳۰6 نوكلئوتيدي را در جدايههاي Cff تكثيرنمايند اين تكثير در ساير باكتريهاي بيمارگر گياهي مورد آزمايش و يا باكتريهاي اپيفيت جداشده از بذر لوبيا صورتنگرفت نتايج نشانداد كه جفت آغازگرهاي اختصاصي معرفيشده در

Detection of Curtobacterium flaccumfaciens pv flaccumfaciens the causal agent of bean bacterial wilt in seed Fatemeh Amini fatemeh amini96@ag iut ac ir June 30 2020 Department of Plant Protection Isfahan University of Technology Isfahan 84156 83111 Iran Degree M Sc Language FarsiSupervisors Masoud Bahar mbahar@cc iut ac irAbstractBean bacterial wilt is one of the serious and damaging diseases of beans which has been reported in recentyears from Iran The disease characterized by interveinal necrosis foliar blight and wilting of the beanplants due to clogging of the xylems by the causal agent Curtobacterium flaccumfaciens pv flaccumfaciens Cff The strains of Cff are seed borne pathogens and posse the potential to spread the disease to the nextseason s crop in new area Since the bean seed is produced and traded across the country sampling anddetection of cff contaminated seed is necessary to reduce the risk of pathogen spread through seed lots Therefore detection of Cff strains on marketed bean seeds the longevity of CFF on seed lots anddevelopment of a validated method for reliable detection of Cff in bean seeds was considered in presentstudy To trace Cff in bean seeds discolored and wrinkled bean seeds were collected from various regionsof Iran Five seeds from each sample were soaked for 12 hours in 10 ml PBS buffer at room temperaturewith gentle agitation by shaking at 100 rpm A loop full of each suspension was streaked on Nutrient agarand semi selective C medium containting 10g peton 1g Casein 0 25g MgSo4 7 H2 O 18g Agar 10g Licland 5g maltose After incubating at 28 for two days the yellow colonies with different morphologieswere picked and recultured In the preliminary examination the genomic diversity analysis of the obtainedisolates was carried out with the use of BOX IR and ERIC1R 2F fingerprinting methods Both the ERICand BOX PCR amplification data revealed the highly genetic heterogeneity of the isolates regardless oftheir regional origin Based on the corresponding dendrogram the isolates clustered in five separate groupsI 13 isolates II 14 isolates III 16 isolates IV six isolates and V four isolates with the exception ofstrain BS54 which showed unique distinct pattern To achieve a genus level identification of the membersof each fingerprint group nearly full length 16S rRNA region of the chosen isolates were amplified usingthe prokaryotic specific primer pair 27F 1492R Sequencing the 1500bp fragment of the isolates alignmentof the sequences and their comparison with the available 16S rRNA sequences of the prokaryotes inGenBank database showed that the isolates of groups I II and III are related to Siccibacter sp Enterobactersp and Kosakonia sp 99 similarity which are known collectively as epiphytic bacteria The membersof distinct groups IV and V have strong homomology 99 72 to the plant pathogenic bacteriaXanthomonas axonopodis pv phaseoli and and Curtobacterium flaccumfaciens pv flaccumfaciens respectively The BS54 isolate was different from those groups and identified as Pantoea sp with 98similarity to Pantoea agglomerans Further detailed morphological physiological biochemical andpathological tests results ensured that the yellow pigmented Gram positive oxidase negative isolates ofgroup IV with sensitivity reaction on tobacco leaves are capable to induce typical wilt symptoms in beanplants Cff specific primer pair Cff FOR2 Cff REV4 also amplified the predicted 306 bp DNA fragmentfrom all Cff isolates of group IV tested which confirmed their taxonomic affiliation to C flaccumfacienspv flaccumfaciens The Cff strains isolated mainly from the seeds taken from Isfahan and Markaziprovinces were found homogenous with respect to their biochemical and molecular characteristics Considering the long term survival of Cff at least 13 months in present research in bean seeds and theimportance of high capacity spread of the bacterium through bean seeds it is necessary to develop an easy sensitive and culture independent method fo

مسعود بهار

امير مساح

بهرام شريف نبي ، رحيم محرابي