پديد آورنده :
عزيزي، نگار
عنوان :
همسانه سازي و بيان دگرساخت ژن كد كننده فيتوكلاتين سنتاز از گياه آفتابگردان (Helianthus annuus) در باكتري اشريشياكلي و بررسي تجمع آرسنيك در باكتري مهندسي شده
مقطع تحصيلي :
كارشناسي ارشد
گرايش تحصيلي :
بيوتكونولوژي
محل تحصيل :
اصفهان : دانشگاه صنعتي اصفهان
صفحه شمار :
هشت، 74ص : مصور، جدول، نمودار
استاد راهنما :
آذر شاه پيري
استاد مشاور :
حسن كريم مجني
توصيفگر ها :
آفتابگردان , فيتوكلاتين سنتاز , فيتوكلاتين , آرسنيك , كادميوم , پروتئين نوتركيب , سويههاي تراريخته , تجمع فلز
استاد داور :
رحيم مهرابي، امير مساح
تاريخ ورود اطلاعات :
1399/11/14
رشته تحصيلي :
مهندسي كشاورزي
تاريخ ويرايش اطلاعات :
1399/11/14
چكيده فارسي :
چكيده آرسنيك يك عنصر بسيار سمي براي سالمتي انسان است متأسفانه به دليل همجواري با مراكز صنعتي برخي از شهرها به شدت با آرسنيك سمي شدهاند امروزه توليد باكتريهاي مهندسي شده كه ميتوانند آرسنيك را در خود تجمع نمايند توجه دانشمندان را به خود جلب كرده است بنابراين شناسايي كالته كنندههاي پروتئيني يا غير پروتئيني در موجودات از اهميت زيادي برخوردار است به طور كلي متالوتيونينها و فيتوكالتينها به عنوان دو گروه پروتئين كالته كننده در گياهان با ميل اتصال زياد به فلزات سنگين شناخته مي شوند به نظر ميرسد كه براي اتصال به آرسنيك فيتوكالتين كارآمدتر از متالوتيونينها هستند فيتوكالتينها خانواده اي از پپتيدهاي غني از سيستئين با فرمول كلي n 2 11 y Glu Cys n Gly هستند كه در يك مسير متابوليكي از گلوتاتيون به عنوان پيش ماده توسط آنزيمي به نام فيتوكالتين سنتاز سنتز ميشوند و در تجمع سم زدايي و متابوليسم يونهاي فلزات سنگين در سلولهاي گياهي نقش دارند فعاليت آنزيم فيتوكالتين سنتاز به شدت توسط يونهاي فلزي مانند كادميوم آرسنيك سرب و جيوه تنظيم ميشود در اين تحقيق به منظور همسانه سازي ژن كد كننده فيتوكالتين سنتاز از گياه Helianthius annuus استخراج RNA و تهيه cDNA با رونويسي معكوس انجام شد با استفاده از آغازگرهاي اختصاصي كه بر اساس توالي فيتوكالتين سنتاز طراحي شد ژن رمزگذار فيتوكالتين سنتاز تكثير و در وكتورهاي بياني pET28a و pET41a همسانه سازي شد سازههاي جديد به سويههاي 3 Rosetta DE منتقل شدند پروتئين His PCS پس از القا با IPTG در سويه R 28 PCS بيان شد با اين حال مقدار غالب پروتئين به شكل اجسام اينكلوژن بادي باقي مانده بود استفاده از شريك الحاقي GST با استفاده از وكتور PET41a در سويه R 41a PCS انتقال پروتئين از فرم نامحلول به محلول را افزايش داد با اين حال هنوز هم مقدار زياد پروتئين در فرم نامحلول باقي ماند براي كنار آمدن با اين مشكل سازه pET41a PCS به 2 Rosetta gami منتقل شد در اين سويه حالليت GST PCS به 07 افزايش يافت به منظور مطالعه سنتز فيتوكالتين HPLC با استفاده از 3 PC به عنوان يك استاندارد تجاري انجام شد توليد فيتوكالتين در حضور يونهاي 3 AS5 AS و 2 Cd توسط HPLC تأييد شد با اين وجود هنگامي كه Rg 41 PCS در محيطي فاقد فلز رشد كرد توليد فيتوكالتين مشاهده نشد اين يافته نشان ميدهد كه فيتوكالتين سنتاز فقط در حضور فلزات فعال است و فعاليت آن منجر به توليد فيتوكالتين ميشود منحني رشد Rg 41 PCS در محيط حاوي يون 5 As و مقايسه آن با منحني رشد شاهد در محيط مشابه مقاومت اين سويه را در برابر يون 5 As نشان ميدهد همچنين اين سويه توانست As5 10 67 mol gDCW را در محيط حاوي 5 0 ميلي موالر 5 As جذب كند اگرچه با توجه به منحني رشد سويه Rg 41 PCS هيچ مقاومتي در برابر 3 As و 2 Cd مشاهده نشد اما اين سويه قادر به جذب As3 7 58 mol gDCW و Cd2 25 97 mol gDCW در محيط حاوي 5 0 ميلي موالر 3 As و 2 Cd بود مقادير انباشت يون در اين سويههاي مهندسي شده بسيار باال است بنابراين ميتوان ژن فيتوكالتين سنتاز را به عنوان ژن مناسبي براي مهندسي ژنتيك باكتريهاي خاك معرفي كرد كلمات كليدي آفتابگردان فيتوكالتين سنتاز فيتوكالتين آرسنيك كادميوم پروتئين نوتركيب سويههاي تراريخته تجمع فلز 1
چكيده انگليسي :
Cloning and heterologous expression of gene encoding phytochelatin synthase from sunflower Helianthis annus in Escherichia coli and study of arsenic accumulation in the engineered bacterium Negar Azizi negarazz1371@gmail com September 20 2020 Department of Agricultural Biotechnology Isfahan University of Technology Isfahan 84156 83111 Iran Degree M Sc language farsi Supervisor Azar Shahpiri a shahpiri@cc iut ac irAbstract Arsenic is a very poisonous element for human health Unfortunately due to proximity with industrial centers some cities are highly poisoned with arsenic Nowadays production of engineering bacteria which can absorb arsenic effectively has caught scientist s attention In general phytochelatins are known as one group of protein chelators in plants with high binding affinity to heavy metals Phytoclatins are a family of cysteine rich peptides and their general formula is y Glu Cys n Gly that n can be from 2 to 11 Phytochelatins are produced in a metabolic pathway from the precursor glutathione by an enzyme called phytochelatin synthase PCS The activity of the enzyme phytoclatin synthase is strongly regulated by metal ions such as cadmium arsenic lead and mercury In the present work RNA was extracted from the leaves of Helianthius annuus and cDNA was prepared by reverse transcription Using the specific primers which was designed based on the PCS sequence the gene encoding PCS was amplified and cloned in the expression vectors pET28a and pET41a The new constructs were transformed to strains Rosetta DE3 The protein His PCS was expressed in R 28 PCS after induction with IPTG in the strain R pET PCS However the dominant amount of protein was remained in the form of inclusion bodies The transfer of protein from insoluble form to soluble fraction was enhanced when the protein was heterologously expressed as GST PCS using pET41a as vector However still the high amount of protein was in the unsalable fraction To cope with this problem the construct pET41a PCS was transferred to Rosetta gami2 In this strain the solubility of GST PCS was enhanced to 70 In order to study the synthesis of phytochelatin the HPLC analysis using PC3 as a commercial standard was performd Phytochelatin production was confirmed in presence of AS3 As5 and Cd2 ions by HPLC Nevertheless when Rg 41 PCS was grown in medium lacking metals no phytochelatin production was observed This finding shows that phytochelatin synthase is active only in presence of metals and its activity leads to phytochelatin production Rg 41 PCS strain growth curve in medium containing As5 ion and its comparison with control strain growth curve in similar medium shows resistance of this strain to As5 ion Also this strain was able to absorb 10 67 lmol gDCW As5 in the medium containing 0 5 mM As5 Although according to growth curve of Rg 41 PCS strain no resistance to As3 and Cd2 was observed but this strain was able to absorb 7 58 mol gDCW As3 and 25 97 mol gDCW in medium containing 0 5 mm As3 and Cd2 The accumulated amounts of ions in these engineered strains have been high Therefore PCS gene can be introduced as a suitable gene for genetic engineering of soil bacteria Key terms Sunflower Phytochelatin synthase Phytochelatin Arsenic Cadmium Recombinant protein Transgenic strains Accumulation of metal 73
استاد راهنما :
آذر شاه پيري
استاد مشاور :
حسن كريم مجني
استاد داور :
رحيم مهرابي، امير مساح
