توصيفگر ها :
آزولا , كشت بافت , القاي كالوس , باززايي , سنجش gus
چكيده فارسي :
توليد غذا براي جمعيت رو به رشد جهان چالشي جدي است كه باعث شده توجه دانشمندان به پيدا كردن منابع جديد و ارزان غذا جلب شود. يكي از اين منابع سرخس آبزي آز¬ولا مي‌باشد كه به دليل محتواي شيميايي ارزشمند خود مانند پروتئين‌ها و رشد آسان و سريع موردتوجه قرارگرفته است. اماهمزمان مشكلاتي همانند توليد تانن كه مانع از جذب پروتئين توسط دام و طيور شده و هم‌چنين مقادير زيادش موجب بروز بيماري مي‌شود استفاده از آز¬ولا را با مانع مواجه كرده است. يكي از راه‌هاي رفع اين مشكلات انجام دستور¬زي ژنتيكي با كشت بافت و انتقال ژن مستقيم است. هدف اين پژوهش بهينه‌سازي كشت بافت سه گونه آزولا با نام‌هاي Azolla filiculoides، A. pinnata، وآز¬ولاي جمع‌آوري‌شده از تالاب انزلي (A. caroliniana) در جهت القاي كالوس و امكان‌سنجي انتقال ژن به آزولا است. بدين منظور در ابتدا بهينه‌سازي رشد سه گونه آزولا در محيط گلخانه در محيط‌هاي كشتIRRI1 و IRRI2 مشخص نمود كه نمونه‌ها در محيط كشتIRRI1 رشد بيشتري دارند. براي مشخص كردن روش مناسب استريل سازي از سه ماده ضدعفوني‌كننده قارچ‌كش مانكوزب (شش ميلي¬گرم در ليتر)، كلريد جيوه(05/0 درصد) و هيپوكلريت سديم (يك درصد) استفاده شد كه در مورد A. caroliniana و A. filiculoides روش متشكل از هر سه ضدعفوني‌كننده و در مورد A. pinnata به دليل حساسيت زياد نسبت به هيپوكلريت سديم، روش داراي قارچ‌كش و كلريد جيوه به‌عنوان روش‌هاي مناسب براي ادامه كار برگزيده شدند. براي القاي كالوس از مقادير مساوي از محيط‌هاي كشت IRRI1 و MS به‌عنوان محيط پايه و ازقطعات اسپوروفيت آزولا به عنوان ريزنمونه استفاده شد. هم¬چنين از تركيبات هورموني2و4- دي كلروفنوكسي استيك اسيد ، بنزيل آمينوپورين، ايندول استيك اسيد، نفتالن استيك اسيد و كاينتين در مقادير مختلف استفاده شد و مشخص گرديد كه مناسب‌ترين محيط كشت براي القاي كالوس محيط‌هاي حاوي غلظت¬هاي 4 و2 ،5/1 ،1 ميلي¬گرم در ليتر 2,4-D و 2 و 5/1 ،1 ميلي¬گرم در ليتر بنزيل آمينوپورين مي‌باشد. در اين تحقيق تلاش در جهت باز¬زايي كالوس¬ها موفقيت‌آميز نبود. پس از رنگ‌آميزي با استوكارمن و تهيه اسلايد و بررسي‌هاي ميكروسكوپي مشخص شد كه كالوس‌هاي به‌دست‌آمده بيشتر به كالوس¬هاي غير جنين¬زا شباهت داشته و به همين علت باز¬زايي در آن‌ها صورت نگرفته است. به دليل آنكه با توليد اسپوروفيت استريل ديگر نيازي به استريل سازي ريزنمونه نيست تيمارهايي جهت اسپورزايي از سه گونه مورد بررسي اعمال شد كه نتيجه¬بخش نبود. بنابراين القاي آگروباكتريوم حامل پلاسميد داراي ژن gus، به آز¬ولاي بالغ كه قبلا عمل تشريح روي آن انجام شده و زنده بودن آن مورد بررسي و تاييد قرارگرفته بود، انجام شد. از طريق مشاهده ميكروسكوپي رنگ آبي حاصل از تجزيه سوبستراي x-gluc توسط آنزيم بتاگلوكورونيداز در نواحي مريستمي و برگ‌هاي ريز¬نمونه انتقال ژن gus تاييد شد. نتايج پژوهش حاضر نشان داد كه امكان انجام دستور¬زي ژنتيكي در آز¬ولا از طريق استفاده از بافت بالغ وجود داشته و بهينه‌سازي كشت بافت و القاي كالوس در آن به ژنوتيپ و تركيب محيط كشت مورداستفاده و اثر متقابل اين دو عامل بستگي دارد.
چكيده انگليسي :
Abstract:
Food production is a serious challenge for the growing population of the world, which has attracted the attention of scientists to new and cheap sources of food. One of these sources is azolla aquatic fern, which has been noted for its valuable chemical content such as proteins and easy and fast growth. At the same time, problems such as the production of tannins, which prevent the absorption of protein by livestock and poultry, and its large amounts cause disease, have hampered the use of azolla. One of the ways to solve these problems is to perform genetic manipulation by tissue culture and direct gene transfer. The aim of this study was to optimize the tissue culture of three species of Azolla, namely Azolla filiculoides, A. pinnata, and azolla collected from Anzali lagoon (A. caroliniana), in order to induce callus and assess the feasibility of gene transfer to Azolla. For this purpose, at first, the growth optimization of azolla in the greenhouse condition using IRRI1 and IRRI2 media showed the more growth of samples in IRRI1 medium. To determine the appropriate sterilization method, three disinfectants namely antifungal (6 mg/L), mercury chloride (0.05%) and sodium sypochlorite (1%) were used. For the A. caroliniana and A. filiculoides all the three disinfectants were used; and in the case of A. pinnata due to its high sensitivity to sodium hypochlorite, the fungicidal method and mercury chloride were chosen as suitable methods. To induce callus, equal amounts of IRRI1 and MS media were used as basal medium, and spores of Azolla sporophytes used as explants. Also, different values of hormonal compounds 2,4-dichlorophenoxy acetic acid, benzyl aminopurine, indole acetic acid, naphthalene acetic acid and kinetin were used, and it was found that the most suitable culture medium for callus induction is media containing concentrations of 1, 1.5, 2 and 4 mg/L 2,4-D and 1, 1.5 and 2 mg/L benzyl aminopurine. In this study, attempts to regenerate calli were not successful. After staining with acetocarmine, preparing slides and microscopic observation, it was found that the obtained calli were more similar to non-embryogenic callus, therefore did not regenerate. Because there is no need to sterilize the explant by producing sterile sporophytes, sporulation treatments were applied from the species, which were not effective. Therefore, Agrobacterium carrying a plasmid with gus gene was inoculated into adult azolla, which had previously been dissected and its viability confirmed. By microscopic observation of the blue color obtained from the degradation of x-gluc substrate by beta-glucuronidase in meristematic areas and leaves, confirmed the transformation of gus gene. The results of the present study show that it is possible to perform genetic manipulation in Azolla through the use of mature tissue and the optimization of tissue culture, and callus induction depends on the genotype and composition of the used culture medium and the interaction of these two factors.
