توصيفگر ها :
آنزيم آنتي اكسيدان , سوپراكسيد ديسموتاز , پايداري , فعاليت , گونههاي فعال اكسيژن , سيگنال ميتوكندريايي
چكيده فارسي :
سوپر اكسيد ديسموتاز يك آنزيم آنتي اكسيدان است كه از سلول‌هاي زنده در برابر اثرات مخرب آنيون سوپراكسيد محافظت مي‌كند. اين آنزيم با احيا آنيون سوپراكسيد، آن را به پراكسيد هيدروژن و اكسيژن مولكولي تبديل مي‌كند. با توجه به نوع يون فلزي موجود در جايگاه فعال اين آنزيم، سه نوع SOD در اندامك‌ها يا سيتوسل سلول‌هاي زنده حضور دارد. اين آنزيم منحصر به فرد در درمان بيماريهايي كه بر مبناي تنش اكسيداتيو ايجاد مي شوند به كار مي‌رود. همچنين از آن به عنوان آنزيم ضد التهاب در علم پزشكي استفاده مي‌شود. تا كنون تلاش‌هاي متنوعي براي بهبود كارايي و پايداري اين آنزيم انجام شده است. با توجه به اين كه گياهاني كه در شرايط تنش زندگي مي‌كنند، سيستم آنتي اكسيداني قوي دارند پس انتظار مي رود گياه حرا كه يك گياه تالابي است و در شرايط محيطي خاص مانند شوري، گرما، غرقابي به سر مي‌برد، داراي آنزيم‌هاي آنتي اكسيدان قوي باشد. هدف از اين تحقيق، بيان، تخليص و ميزان پايداري آنزيم در دما و pH هاي مختلف فعاليت آنزيم Mn-SOD از گياه حرا بود. بدين منظور ژن كد كننده Mn-SOD يك بار به صورت دست نخورده(MnSOD) و بار ديگر بدون توالي سيگنال ميتوكندريايي(tMnSOD) در وكتور بياني pET-28a(+) كلون شد و سپس اين پلاسميدهاي نوتركيب به باكتري اشرشيا كلي سويه Rosetta–DE3 منتقل شد. پس از مشاهده بيان پروتئين، اين آنزيم‌ها به دليل داشتن دنباله‌ي پلي هيستيدين توسط ستون كروماتوگرافي تمايلي بر پايه نيكل خالص سازي شدند. اگرچه پروتئين ها به خوبي بيان شدند ولي پروتئين MnSOD با وزن 29 كيلودالتون و طول 264 اسيدآمينه وارد فاز نامحلول شد و خالص سازي آن صورت نگرفت. در مقابل پروتئينtMnSOD با وزن 8/26 كيلودالتون و طول 243 اسيد آمينه پس از بيان وارد فاز محلول شد و به خوبي خالص شد. فعاليت اين آنزيم با روش زانتين و زانتين اكسيداز سنجيده شد و تاثير افزودن يون فلزي موجود در جايگاه فعال آنزيم با افزودن اين يون به محيط كشت باكتري، در ميزان توليد پروتئين نوتركيب و فعاليت آنزيم ارزيابي شد. همچنين، پايداري آنزيم tMnSOD در بازه دمايي 25 تا 75 درجه سلسيوس و بازه pH 4 تا 12 سنجيده و با آنزيمCuZnSOD گياه حرا كه قبلا توليد و خالص سازي شده بود،مقايسه شد. سپس شرايط بهينه فعاليت اين آنزيم مورد بررسي قرار گرفت. افزودن يون فلزي منگنز به محيط كشت باكتري باعث افزايش حلاليت پروتئين شد و فعاليت اين آنزيم را افزايش داد. فعاليت آنزيمي CuZnSOD و tMnSOD به ترتيب U/mg5962 و U/mg1600 ارزيابي شد كه نشان مي‌دهد فعاليت آنزيم CuZnSOD از فعاليت tMnSOD بسيار بالاتر مي‌باشد. دماي بهينه براي فعاليت آنزيم tMnSOD 37 و براي آنزيم CuZnSOD 50 درجه سلسيوس بود و هر دو آنزيم در 6 pH بهترين فعاليت خود را داشتند با اين حال پايداري آنزيم CuZnSOD از tMnSOD در شرايط مختلف بسيار بيشتر بود. نتايج حاصل از رسم نمودار باكتري نوتركيب حامل اين دو پروتئين نشان داد دو پروتئين مذكور در ايجاد مقاومت به شوري تاثيري مثبت دارند و تاثير tMnSOD بيشتر است.
چكيده انگليسي :
Superoxide dismutase protects living cells from the damaging effects of superoxide anion as an antioxidant enzyme. This enzyme converts the superoxide anion to hydrogen peroxide and molecular oxygen by it's reducing. There are three types of SOD in cells of different organism. These SODs are related to the type of metal ion present at the active site of SOD. This unique enzyme is used to treat diseases based on oxidative stress. It is also used as an anti-inflammatory enzyme in medicine. Today, various efforts have been made to improve the efficiency and stability of this enzyme. Plants that live in stressful conditions have a strong antioxidant system, so it is expected that Avicennia marina contains strong antioxidant enzymes, because it is a wetland plant and lives in special environmental conditions such as salinity, heat, flooding, etc. This research was performed to clone, express, purify and characterize of a novel MnSOD from Avicenna marina. For this purpose, the gene encoding Mn-SOD was cloned in two modes: 1) intact (MnSOD) and 2) without mitochondrial signal peptide (tMnSOD) in the expression vector pET-28a (+). Then these recombinant plasmids were transferred to Escherichia coli strain Rosetta (DE3). After observing protein expression, these enzymes were purified by nickel-based chromatography column due to having a His-tag sequence at the N- terminal of protein sequence. Although the proteins were well expressed, the 29 kDa MnSOD protein with a length of 264 amino acids entered the insoluble phase and was not purified. In contrast, tMnSOD protein entered the solution phase after expression and was well purified (weight 26.8 kDa and length 243 amino acids). The activity of this enzyme was measured by xanthine and xanthine oxidase methods, and the effect of adding metal ions in the active site of the enzyme was evaluated by adding this ion to the bacterial culture medium, in the amount of recombinant protein production and enzyme activity. Also, the stability of tMnSOD enzyme was measured in the temperature range of 25 to 75̊ C and pH rang of 4 to 12 and finally, it was compared with previously produced and purified CuZnSOD from Avicenna marina. Then the optimal conditions of this enzyme activity were investigated. Addition of Mn metal ion to the bacterial culture medium increased the solubility of the protein and increased the activity of this enzyme. The activity of recombinant and purified His- CuZnSOD and His-tMnSOD were evaluated 5962U/mg and 1600U/mg respectively, indicating that CuZnSOD activity was much higher than tMnSOD activity. The optimum temperature for the activity of the enzyme tMnSOD and CuZnSOD was37 and 50 ° C, respectively; and both enzymes had their best activity at pH 6. However, under different conditions the stability of CuZnSOD enzyme was much higher than tMnSOD. The results of plotting the recombinant bacteria carrying these two proteins showed that the two proteins have a positive effect on salinity resistance and the effect of tMnSOD is greater.
