توصيفگر ها :
Avicennia marina , سوپر اكسيد ديسموتاز , آنتي‌بادي پلي‌كلونال , گونه‌هاي فعال اكسيژن , تنشهاي نمك و سرب
چكيده فارسي :
گياه حرا با نام علمي Avicennia marina (Forsk.) Vierh ، گونه‌اي از گياهان مانگرو واقعي است كه در مناطق جنوبي ايران يافت مي‌شود. واكنش‌هاي تطبيقي گسترده‌اي در گياه تكامل يافته‌است كه حرا را براي رشد در محيط‌هاي تنش‌زا سازگار مي‌كند. گونه‌هاي فعال اكسيژن(ROS) در بخش‌هاي مختلف سلول‌هاي هوازي در شرايط طبيعي و پاتوژنيك توليد مي‌شود. بروز تنش در گياهان و جانوران ظرفيت آنتي‌اكسيداني ارگانيسم را از طريق تجمع بيش از حد اين گونه‌هاي فعال تحت تأثير قرار مي‌دهد و موجب آسيب‌هاي بسياري در سلول مي‌شود. سوپر اكسيد ديسموتاز يكي از آنزيم‌هاي آنتي‌اكسيداني ضروري در سيستم‌هاي دفاعي، با تجزيه راديكال سوپراكسيد از سلول در برابر آسيب‌هاي گونه‌هاي فعال اكسيژن و نيتروژن حفاظت مي‌كند. در اين پژوهش در ابتدا نهال‌هاي گياه حرا در دوره 12 برگي تحت تيمار نمك و سرب قرار گرفتند و از برگ‌هاي گياه حرا نمونه‌برداري انجام شد. پروتئين‌هاي نوتركيبAmSOD1 و AmSOD2گياه حرا كه به ترتيب نوعي CuZnSODو MnSODهستند، در باكتريE.coli به صورت His-AmSOD1 و His-AmSOD2 بيان شدند. سپس مراحل استخراج پروتئين نوتركيب از محتوي پروتئيني باكتري، خالص‌سازي، دياليز و تعيين غلظت انجام شد و پروتئين نوتركيب خالص به عنوان آنتي‌ژن براي توليد آنتي‌بادي به خرگوش تزريق شد. در ادامه با استخراج پروتئين از نمونه‌هاي برگ گياه حرا و انجام وسترن بلات، بيان آنزيم‌هاي AmSOD1و AmSOD2 در سطح پروتئين در نمونه‌هاي تحت تيمار مورد بررسي قرار گرفتند و سنجش فعاليت سوپر اكسيد ديسموتاز نيز انجام شد. در مرحله ديگر پژوهش، ميزان مقاومت به تنشهاي نمك، استات سرب، اتانول و هيدروژن پراكسيد در سويه كنترل و دو سويه تراريختAmSOD1 و AmSOD2 باكتري E.coli نيز بررسي شد. نتايج پژوهش نشان داد كه تنش نمك و سرب باعث افزايش بيان در سطح پروتئين در هر دو پروتئين AmSOD1 و AmSOD2 در مقايسه با شرايط كنترل مي‌شوند. اما تأثير تنش سرب در افزايش مقدار دو پروتئين بيشتر است. همچنين بررسي فعاليت آنزيم نيز مشخص كرد تحت تنش در زمان‌هاي ابتدايي نمونه‌برداري، فعاليت آنزيم‌هاي سوپراكسيد ديسموتاز افزايش داشته است و با گذشت زمان، فعاليت پروتئين كاهش يافت. بررسي ميزان مقاومت سويه‌هاي كنترل و تراريخت در باكتري نيز نشان داد در تنشهاي نمك، استات سرب و اتانول اعمال شده در محيط كشت سويه‌ها، اگرچه القاي ژن‌هاي كدكننده AmSOD1وAmSOD2 و تغيير در فعاليت آنزيم‌هاي آنتي‌اكسيداني AmSOD1 و AmSOD2 در هر دو سويه تراريخت، منجر به مقاومت اين سويه‌هاي باكتري در برابر تنش در مقايسه با سويه كنترل شدند، اما ژن كدكننده AmSOD1گياه حرا در باكتري در القاي مقاومت در برابر تنشهاي اكسيداتيو مؤثرتر است. به طور كلي پژوهش حاضر نشان داد كه هر دو آنزيم آنتي‌اكسيداني مورد بررسي، در مكانيسم‌هاي دفاعي آنتي‌اكسيداني به منظور كاهش آسيب و سميت‌زدايي راديكال سوپراكسيد ناشي از تنشهاي غير زيستي هم در گياه حرا و هم در باكتري، نقشي اساسي دارند و در مقايسه دو آنزيم AmSOD1 و AmSOD2، مشخص شد آنزيم AmSOD1 در سيستم دفاعي آنتي‌اكسيداني تأثير بيشتري دارد.
كلمات كليدي: Avicennia marina ، سوپر اكسيد ديسموتاز، آنتي‌بادي پلي‌كلونال، گونه‌هاي فعال اكسيژن، تنشهاي نمك و سرب
چكيده انگليسي :
Abstract
Avicennia Marina (Forsk.) Vierh is a species of true mangrove plants which is found in the southern regions of Iran. Extensive adaptive responses have evolved in plants that adapt mangroves to grow in stressful environments. Reactive oxygen species (ROS) are produced in different parts of aerobic cells under normal and pathogenic conditions. The occurrence of stress in plants and animals affects the antioxidant capacity of the organism through excessive accumulation of these reactive species and the creation of oxidative stress and causes many damages in the cell. Superoxide dismutase, one of the essential antioxidant enzymes in defense systems, protects the cell against the damage of reactive oxygen and nitrogen species by decomposing the superoxide radical. In this research, at first, mangrove seedlings were subjected to salt and lead treatment in the 12-leaf period. The recombinant proteins AmSOD1 and AmSOD2 of A.marina, which are a type of CuZnSOD and MnSOD, respectively, were expressed in E.coli. They were expressed as His-AmSOD1 and His-AmSOD2. Then the steps of extracting the recombinant protein, purification, dialysis and determination of concentration were performed and the pure recombinant protein was injected into rabbits as an antigen to produce antibodies. Next, by extracting protein from A.marina leaf samples and performing western blotting, the expression of AmSOD1 and AmSOD2 enzymes at the protein level in the treated samples was investigated, and superoxide dismutase activity was also measured. In another stage of the research, the level of resistance to salt, lead acetate, ethanol and hydrogen peroxide stresses in the control strain and two transgenic strains AmSOD1 and AmSOD2 of E.coli was also investigated. The results of the study showed that salt and lead stress increase the protein expression in both AmSOD1 and AmSOD2 proteins compared to the control conditions. But the effect of lead stress is greater in increasing the amount of two proteins. Also, the examination of enzyme activity also revealed that under stress in the early stages of sampling, the activity of superoxide dismutase enzymes increased, and with the passage of time, protein activity decreased. The investigation of the resistance of the control and transgenic strains in bacteria also showed that under salinity stress, lead acetate and ethanol applied in the culture medium of the strains, although the induction of AmSOD1 and AmSOD2 coding genes and the change in the activity of the antioxidant enzymes AmSOD1 and AmSOD2 in both transgenic strains lead to resistance These bacterial strains were resistant to stress compared to the control strain, but the A.marina AmSOD1 coding gene in bacteria is more effective in inducing resistance to oxidative stress. In general, the current research showed that both the investigated antioxidant enzymes play a fundamental role in the antioxidant defense mechanisms in order to reduce damage and superoxide anion detoxification caused by abiotic stresses in both A.marina and bacteria, and in the comparison of the two AmSOD1 enzymes and AmSOD2, it was found that AmSOD1 enzyme has a greater effect on the antioxidant defense system.
Keywords: Avicennia marina , superoxide dismutase, polyclonal antibody, reactive oxygen species, salinity and lead stresses.
