18241

15885

كارشناسي ارشد

بيوتكنولوژي

اصفهان : دانشگاه صنعتي اصفهان

1401

يازده، 59ص.: مصور، جدول، نمودار

1401/12/02

كتابنامه

كشاورزي

مهندسي كشاورزي

1401/12/08

2908973

در طول چندين سال گذشته، به دليل وجود ويژگي‌هاي منحصر به فرد سيستم‌هاي بياني مبتني بر گياه از قبيل، توليد بيشتر در مدت زمان كمتر، عدم وجود پاتوژن‌هاي انساني يا سموم و هزينه كمتر نسبت به ساير سيستم‌ها، توجه داشمندان به سمت توسعه گياهان تراريخته در زمينه توليد پروتئين دارويي در مقياس بزرگ جلب شده است. يكي از مهم‌ترين پروتئين‌هاي دارويي در تجزيه لخته‌هاي خون در قسمت‌هاي مختلف بدن، فعال كننده پلاسمينوژن نوع بافتي انساني(t-PA) است. هدف از انجام پژوهش حاضر، بررسي ميزان بيان ژن t-PA در دو روش متفاوت انتقال موقت و در سه بازه زماني 5، 7 و 9 روز مي‌باشد. در اين پژوهش، سازه حاوي ژن t-PA در آگروباكتريوم با استفاده از آزمون colony PCR تاييد گرديد، سپس ژن مورد نظر به دو روش متفاوت به گياه توتون منتقل شد. در روش اول با استفاده از يك سرنگ بدون سوزن مايه‌ي تلقيح به سطح زيرين برگ تزريق شد و در روش دوم سطح برگ به وسيله‌ي سوزن خراشيده شد و گوش پاك كن آغشته به مايه‌ي تلقيح بر سطح خراش كشيده شد. در نهايت نتايج آناليز گياهان تراريخت در دو سطح RNA و پروتئين بررسي گرديد. از برگ‌هاي گياهان تراريخت استخراج RNA صورت گرفت و cDNA سنتز شد سپس cDNA سنتز شده، براي آزمون RT-PCR مورد استفاده قرار گرفت. همچنين در سطح پروتئين، از برگ گياه توتون تراريخت، پروتئين كل استخراج گرديد و آزمون SDS-PAGE انجام شد. آناليز داده‌هاي حاصل از آزمون RT-PCR نشان داد در روش تزريق ميزان بيان ژن در روزهاي متفاوت با يكديگر اختلاف معني داري دارند ولي در خراش اين اختلاف معني دار نيست. در روش تزريق بيشترين ميزان بيان ژن در روز پنجم پس از تلقيح به دست آمد ولي در روش خراش در هر سه بازه زماني ميزان بيان ژن هدف بسيار اندك بود. در بررسي الگوهاي باندي الكتروفورزي پروتئين تفاوت مشهودي از نظر وجود باند اضافي در نمونه‌هاي برگ‌هاي تزريق شده با آگروباكتريوم حاوي ناقل نسبت به برگ‌هاي شاهد مشاهده نشد. وجود مقدار اندك پروتئين و عدم بهينه‌سازي كدون‌هاي ژن مذكور براي بيان در سيستم يوكاريوتي مي‌تواند دليل بر اندك بودن مقدار پروتئين توليد شده باشد. روش آگرواينفيلتراسيون در روزهاي متفاوت ميزان بيان ژن هدف بيشتري را نسبت به خراش سطح برگ داشت، بنابراين مي‌توان نتيجه گيري كرد كه انتقال ژن به روش آگرواينفيلتراسيون مناسب‌تر است و ميزان بيان ژن هدف در اين روش بيشتر مي‌باشد. به طور كلي، مي‌توان نتيجه گرفت كه نوع روش انتقال بر ميزان بيان ژن تاثيرگذار است، لذا انتخاب بهترين روش انتقال باعث افزايش ميزان بيان ژن هدف در گياه مي‌شود كه مي‌تواند پروتئين دارويي مورد نياز را باصرف هزينه كمتر در مقياس وسيع در اختيار بيماران قرار دهد.

Over the past several years due to the unique characteristics of plant-based expression systems such as more production in less time, absence of human pathogens or toxins and lower cost than other systems, the attention of scientists has been drawn towards the development of transgenic plants in the field of large-scale production of medicinal proteins. One of the most important medicinal proteins in the breakdown of blood clots in different parts of the body is human tissue-type plasminogen activator (t-PA). The purpose of the current research is investigating the level of t-PA gene expression in two different transient transfer methods and it is in three time periods of 5, 7 and 9 days. In this research, the construct containing the t-PA gene in Agrobacterium was confirmed using the colony PCR test. Then the desired gene was transferred to the tobacco plant in two different methods. In the first method, using a syringe without a needle, the inoculum source was injected into the lower surface of the leaf and in the second method, the leaf surface was scratched by a needle and the ear cleaner dipped in the inoculum source was drawn on the scratched surface. Finally, the results of the analysis of transgenic plants were analyzed in both RNA and protein levels. The RNA was extracted from the leaves of the transgenic plants and the cDNA was synthesized. Then the synthesized cDNA was used for RT-PCR test. Also at the protein level, The total protein was extracted from the leaves of the transgenic tobacco plant and the SDS-PAGE test was performed. The analysis of the data obtained from the RT-PCR test showed that there are significant differences in the gene expression levels on different days in the injection method but this difference is not significant in scratching method. In the injection method, the highest amount of gene expression was obtained on the fifth day after inoculation, but in the scratching method, the expression of target gene was very low in all three time periods. In the examination of protein electrophoresis band patterns, no obvious difference was observed in terms of the presence of additional bands in the samples of leaves injected with Agrobacterium containing the vector compared to the control leaves. The existence of a small amount of protein and the lack of optimization of the codons of the mentioned gene for expression in the eukaryotic system can be the reason for the low amount of protein produced. The Agroinfiltration method on different days showed more expression of target gene than scratching method. Therefore, it can be concluded that gene transfer by agro-infiltration method is more suitable and the expression of target gene is higher than scratching method. In general, it can be concluded that the type of transfer method affects the level of gene expression. Therefore, choosing the best transfer method increases the expression of the target gene in the plant, which can provide patients with the needed medicinal protein at a lower cost on a large scale.

اقافخر ميرلوحي فلاورجاني , ابوذر سورني

اقافخر ميرلوحي فلاورجاني , ابوذر سورني