توصيفگر ها :
ويروس پژمردگي لكه اي گوجه فرنگي , ويروس چروكيدگي قهوه اي ميوه گوجه فرنگي , RT-PCR , Frankliniella occidentalis , راندمان انتقال
چكيده فارسي :
فلفل‌دلمه‌اي ( (Capsicum annuum L.گياهي با ارزش اقتصادي بالا است و توسط ويروس‌هاي مختلفي آلوده مي‌شود. در بين ويروس‌هاي بيمارگر فلفل‌دلمه‌اي ، ارتوتاسپوويروس‌ها و توباموويروس‌ها از اهميت بيشتري برخوردار هستند. در سال‌هاي اخير علايم ويروسي بر روي فلفل‌دلمه‌اي مشابه علايم ايجاد شده توسط ارتوتاسپوويروس‌ها و توباموويروس‌ها شامل لكه‌هاي حلقوي سبزرد و بافت مرده بر روي برگ و ميوه و همچنين علايم موزاييك برگ و بدشكلي ميوه‌ها و ايجاد لكه‌هاي قهوه‌اي تا سياه رنگ بر روي آن‌ها در گلخانههاي موجود در استان اصفهان مشاهده شده‌است. به منظور شناسايي ارتوتاسپوويروس‌ها و ويروس چروكيدگي قهوه‌اي ميوه گوجه‌فرنگي tomato brown rugose fruit virus (ToBRFV) از جنس Tobamovirus طي سال‌هاي 1401-1399 از گلخانههاي فلفل‌دلمه‌اي در استان اصفهان با علايم ويروسي نمونه‌برداري انجام شد. از برگ‌ها و ميوه‌هاي فلفل‌دلمه‌اي، RNA كل به روش CTAB استخراج گرديد و در آزمون RT-PCR با استفاده از آغازگرهاي اختصاصي جنس ارتوتاسپوويروس و توباموويروس، آغازگرهاي اختصاصي گونه‌هاي ويروس كلروز فلفل‌دلمه‌اي (CaCV)capsicum chlorosis virus ، ويروس نكروز جوانه بادام‌زميني groundnut bud necrosis virus (GBNV)، ويروس پژمردگي لكه‌اي گوجه‌فرنگي tomato spotted wilt virus (TSWV) و ToBRFV بررسي شدند. از نمونه‌هايي كه داراي علايم لكه‌هاي حلقوي سبزرد و بافت مرده بر روي برگ‌ها و ميوه‌ها بودند، قطعه مورد انتظار bp810 با جفت آغازگر اختصاصي جنس ارتوتاسپوويروس‌ها FJJ200274/FJJ200275 و جفت آغازگر اختصاصي TSWV، FJJ200274/FJJ200275 تكثير شد ولي قطعات مورد انتظار با جفت آغازگرهاي اختصاصي GBNV و CaCV در هيچكدام از نمونه‌ها تكثير نشدند. همچنين، در تعدادي از نمونه‌ها با علايم موزاييك و بدشكلي برگ‌ها و لكه‌هاي قهوه‌اي تا سياهرنگ بر روي ميوه در RT-PCR قطعات مورد انتظار جنس توباموويروس و ToBRFV به ترتيب با جفت آغازگرهاي ToBamo-F/ToBamo-R و ToBRFV-F/ToBRFV-R با اندازه هاي bp 750 و bp 560 تكثير شدند. قطعات تكثير شده با جفت آغازگرهاي اختصاصي TSWV و ToBRFV به صورت مستقيم توالي‌يابي شدند و در آزمون BLASTn داراي شباهت بالايي به ترتيب با ژن نوكلئوكپسيد جدايه‌هاي TSWV و ژن پليمراز جدايه هاي ToBRFV موجود در GenBank بودند. به منظور انجام مقايسه‌هاي مولكولي، تعداد چهار جدايه از TSWV و سه جدايه از ToBRFV جهت توالي‌يابي ارسال شدند. همرديف‌سازي چندتايي براساس توالي نوكلئوتيدي ژن نوكلئوكپسيد جدايه‌هاي TSWV و قسمتي از ژن پليمراز جدايه هاي ToBRFV با تعدادي از جدايه‌هاي موجود در GenBank با استفاده از نرم‌افزار DNAMAN 4.0 انجام شد. بر اساس نتايج حاصل از همرديف‌سازي، ميزان يكنواختي بين جدايه‌هاي ايراني TSWV، از 7/99% تا 100% و با جدايه‌هاي موجود در بانك ژن بيشتر از 7/96 % و بين جدايه‌هاي ايراني ToBRFV از 6/99% تا 8/99% و با جدايه‌هاي موجود در بانك ژن بيشتر از 6/99 % بود. رسم درخت تبارزايي بر اساس توالي نوكلئوتيدي ژن نوكلئوكپسيد جدايه‌هاي TSWV به روش Neighbor-Joining با 1000 بار تكرار با استفاده از نرم‌افزار DNAMAN 4.0 انجام شد. بر اين اساس همه جدايه‌هاي اين پژوهش در يك كلاد قرار گرفتند و بيشترين ارتباط را با جدايه TSWV-VE427 از اسپانيا (DQ376185) داشتند. براي تعيين راندمان انتقال TSWV توسط لارو سن دوم و بالغين Frankliniella occidentalis از روش برگ‌هاي جدا شده اطلسي استفاده شد. راندمان انتقال اين ويروس توسط لاروهاي سن دوم و بالغين به ترتيب 33 و 5/42 درصد (65 درصد براي نرها و 30 درصد براي ماده‌ها) بدست آمد. رديابي ويروس TSWV در بدن بالغين F. occidentalis با استفاده از جفت آغازگر FJJ200274/FJJ200275 در دسته‌هاي ده‌تايي، سي‌تايي و پنجاه‌تايي تريپس انجام شد. باند مورد انتظار در تريپس‌هاي بالغ viruliferous تكثير شد ولي هيچ قطعه‌اي در تريپس‌هاي non-viruliferous تكثير نگرديد. با توجه به شيوع بالاي ويروس‌هاي TSWV و ToBRFV در گلخانههاي فلفل‌دلمه‌اي لزوم مديريت بيماري با استفاده از روش‌هاي كارآمد از جمله ارقام مقاوم ضروي به نظر مي‌رسد.
چكيده انگليسي :
The bell pepper (Capsicum annuum L.) is a high-value crop, which is infected by different viruses. Orthostospoviruses and tobamoviruses are considered the most important pathogenic viruses of bell pepper. recently, viral symptoms on bell pepper similar to those caused by orthostospoviruses and tobamoviruses including chlorotic and necrotic spots on leaves and fruits, as well as leaf mosaic symptoms, fruit malformation and brown to black spots on fruits, have been observed in greenhouse bell pepper in Isfahan province. To identify orthotospoviruses and tomato brown rugose fruit virus (ToBRFV; genus Tobamovirus) the leaf and fruit samples were collected from greenhouse bell pepper showing viral symptoms in Isfahan province from 2019 to 2022. Total RNA was extracted by the CTAB method and subjected to RT-PCR using specific primer pairs of Orthostospovirus genus, FJJ200274/FJJ200275 and Tobamovirus genus, Tobamo-F/Tobamo-R and specific primer pairs of capsicum chlorosis virus (CaCV), CaCV-F/CaCV-R, groundnut bud necrosis virus (GBNV), GBNV-F/GBNV-R, tomato spotted wilt virus (TSWV), gl3637/gl4435 and ToBRFV, ToBRFV-F/ToBRFV-R. In samples with symptoms of chlorotic and necrotic ring spots on leaves and fruits, the expected fragment of 810 bp was amplified in RT-PCR by FJJ200274/FJJ200275 and gl3637/gl4435 primer pairs, while no amplification was done by GBNV and CaCV specific primer pairs. additionally, the expected fragments of 750 bp and 560 bp were amplified in RT-PCR by ToBRFV-F/ToBRFV-R and ToBRFV-F/ToBRFV-R primer pairs, respectively, in some samples with mosaic and leaf malformation, brown to black spots on the fruit. The amplified segments using gl3637/gl4435 and ToBRFV-F/ToBRFV-R primer pairs were directly sequenced and showed high identity with the nucleotide sequence of the nucleocapsid and polymerase genes of TSWV and ToBRFV isolates, respectively, available at GenBank in the BLAST search. For the genetic variation study, four isolates of TSWV and three isolates of ToBRFV were aligned with some TSWV and ToBRFV isolates available at GenBank based on the nucleotide sequences of the nucleocapsid and polymerase genes, respectively, by using DNAMAN 4.0 software. Based on the results, the identity among Iranian TSWV isolates ranged from 96.3% to 100% and with TSWV isolates available at GenBank was more than 96.3% and among Iranian ToBRFV isolates from 99.6% to 100% and it was more than99.6% with ToBRFV isolates available at GenBank. Phylogenetic tree was constructed based on the nucleotide sequence of the nucleocapsid gene of TSWV isolates using the Neighbor-Joining method with 1000 bootstrap replicates by using DNAMAN 4.0 software. All the TSWV Iranian isolates were grouped in one clade and showed the closest relationship with TSWV-VE427 isolate from Spain (DQ376185). The Transmission efficiency of TSWV by second-instar larvae and adults of Frankliniella occidentalis was determined using the detached petunia leaf method. The results showed that the transmission efficiency of second-instar larvae and adults were 33% and 42.5% (65% for males and 30% for females), respectively. Detection of TSWV virus in adults of F. occidentalis was performed, in 10, 30 and 50-thrips groups using FJJ200274/FJJ200275 primer pair in RT-PCR. The expected fragment was amplified in viruliferous thrips; however, no band was amplified in non-viruliferous thrips. Due to the high incidence of TSWV and ToBRFV viruses in greenhouse bell pepper, it is necessary to use efficient methods including resistant cultivars for disease control.
