توصيفگر ها :
گال طوقه , رز شاخه بريده , اگروباكتريوم , rep-PCR
چكيده فارسي :
چكيده
بيماري گال طوقه يكي از بيماري هاي مهم و اقتصادي در گلخانه هاي گل رز مي باشد كه توسط گونه هاي داراي پلاسميد بيماريزاي باكتري Agrobacterium spp. از خانواده Rhizobiaceae ايجاد مي شود. عامل بيماري به مدت طولاني در خاك باقي مي ماند و پس از ورود به گياه ميزبان، از طريق ادغام ژنتيكي بخشي از پلاسميد بيماريزاي خود تحت نام T-DNA ، با اختلال در تقسيم سلولي گياه موجب بروزگال در ناحيه ريشه، طوقه و شاخه ها مي گردد. با توسعه گال و ايجاد فشار به سيستم آوندي گياه، انتقال آب و مواد غذايي به قسمت هاي هوايي گياه مختل شده و گياهان مبتلا به گال ضعيف شده و يا از بين مي روند. مشخص شده است كه بعضي از اگروباكتريوم هاي فاقد پلاسميد بيماريزا نيز در شيره نباتي گياهاني مانند رز، مو و داوودي، بصورت سيستميك وجود دارند كه باعث ايجاد بيماري نمي شوند. به دليل امكان انتقال پلاسميد بين گونه هاي مختلف اگروباكتريوم، احتمال انتقال ژن بين اين باكتريها و ظهور نوتركيب هاي جديد وجود دارد. چنين فرايندي مي- تواند به افزايش تنوع ژنتيكي گونه ها و يا ظهور بيوتيپ هاي جديد Agrobacterium spp. كمك نمايد. به اين لحاظ، آگاهي از حضور انواع اگروباكتريوم هاي بيماريزا و غير بيماريزا در گال و نيز شيره گياهي ميزبان، ضمن كمك به تشخيص عامل بيماري و آگاهي از فراواني نسبي گونه هاي بيماريزا در ميزبان، اطلاعات مناسبي نيز از رفتارهاي اكولوژيكي گونه- هاي مختلف اگروباكتريومي بدست مي دهد.بنابراين، تشخيص دقيق باكتري بيمارگر گال طوقه رز، بررسي تنوع ژنتيكي و آگاهي از بيماريزا يا غير بيماريزا بودن جدايه هاي اگروباكتريومي بدست آمده در قلمه ها و پايه هاي رز وارداتي به كشور و بررسي مطابقت گونه ها يا ژنوم وارهاي عامل گال طوقه رز درگال و شيره نباتي هر نمونه، از اهداف پژوهش حاضر تعيين شد. به اين منظور، طي سال هاي 1402-1400 نمونه هايي از رزهاي مبتلا به گال از گلخانه هاي استان اصفهان و در موارد معدودي استان تهران جمع آوري شد. پس از جداسازي باكتري از گال نمونه ها و همچنين شيره نباتي تعدادي از آنها، تمام جدايه ها تحت واكنش PCR با جفت آغازگر عمومي RGF/RGR قرار گرفتند و جدايه هايي كه در آنها تك باند اختصاصي bp517 تكثير گرديد، به عنوان جدايه هاي متعلق به جنس اگروباكتريوم انتخاب شدند. انگشت نگاري ژنتيكي اين جدايه ها با آغازگرهاي BOX1R و ERIC1/ERIC2 (rep-PCR) نشان داد كه تنوع ژنتيكي زيادي بين 64 جدايه مورد بررسي در اين پژوهش وجود دارد كه در پنج گروه متفاوت دسته بندي شدند. با مقايسه الگوي باندي جدايه هاي گال و شيره آوندي مربوط به همان نمونه گال با استفاده از آزمون ERIC-PCR مشخص شد كه به غير از دو جدايه Ag133 (گال) و Ag133s (شيره آوندي)، ساير جدايه هاي استخراج شده از گال و شيره آوندي مربوط به همان نمونه، الگوي انگشت نگاري ژنتيكي مشابهي ندارند. در آزمون بيماريزايي جدايه ها روي ديسك هاي هويج و تعدادي جدايه منتخب در ساقه گياهان فلفل، شمعداني و گوجه فرنگي، همه آنها به جز سه جدايه Ag108، Ag118 و Ag130 در ميزبان هاي خود توليد گال كردند. با استفاده از آزمون هاي بيوشيميايي، تعلق اكثر جدايه هاي اين پژوهش به A.tumefaciens biovar 1 تاييد شد، هرچند نتايج اين آزمون ها با گروه بندي جدايه ها برمبناي rep-PCR مطابقت نداشت. طي واكنش هاي PCR با جفت آغازگرهاي طراحي شده براساس توالي نواحي ژن هاي پلاسميدي دخيل در بيماريزايي مانند VCF/VCR، VirD2A/VirD2C′ و tms2A/tms2B ، تك باندهاي نوكلئوتيدي با اندازه هاي مورد انتظار در جدايه ها تكثير شد، ولي جدايه Ag130 باند اختصاصي bp 224 (VirD2A/VirD2C′) را تكثير نكرد. طي آزمون PCR با جفت آغازگرهاي اختصاصي توليد اپين، جدايه هاي مورد بررسي در اين پژوهش، استرين هاي توليدكننده نوپالين تشخيص داده شدند. اگرچه استفاده از روش هاي بيوشيمايي و rep-PCR كمكي به شناسايي گونه جدايه هاي مورد بررسي نكرد، ولي با ترسيم درخت فيلوژني براساس جفت آغازگرهاي مبتني بر ژن هاي housekeeping معلوم شد كه جدايه Ag101 به A.rubi ، جدايه هاي همگروه با Ag104 به ژنوم وار نزديك G19 و جدايه هاي همگروه با Ag166 به ژنوم وار G7 شبيه هستند. شباهت زياد جدايه هاي غير بيماريزاي Ag108 و Ag130 به جنس Brucella از يافته هاي جالب توجه اين پژوهش بود، چرا كه باكتريهاي spp. Brucella از جمله پاتوژن هاي جانوري محسوب مي شوند و گزارشي از بيمارگري آنها روي گياهان وجود ندارد. با در نظرگرفتن مجموع نتايج آزمونهاي بيوشيميايي و روش هاي مولكولي و نيز تجزيه و تحليل توالي هاي چند لوكوسي(MLSA)، به نظر مي رسد كه جدايه هاي باكتريايي عامل بيماري گال رز در اين پژوهش از تنوع بالايي برخوردار هستند و شناسايي دقيق ژنوم وارهاي آنها به زمان بيشتري نياز دارد.
چكيده انگليسي :
Crown gall disease is an economically important disease of greenhouse-grown rose plants caused by pathogenic species of Agrobacterium spp., belong to the Rhizobiaceae family and carry tumor-inducing plasmids.The pathogen survives in the soil and, Upon penetration of the host plant, the pathogen causes gall formation on the surface of the roots, crown and branches through the genetic integration of part of its pathogenic plasmid (T-DNA). The gall formation and pressure on the plant's vascular system disrupts the transfer of water and nutrients to the above-ground parts of the plant and the affected host weaken or die. Certain agrobacteria lacking pathogenic plasmids are also present in the vascular sap of plants such as rose, vine, and chrysanthemum in a systematic manner which are not involved in gall formation. The possibility of plasmid transfer among diverse Agrobacterium species suggests the potential for gene transfer among them, which could enhance the genetic variation of the species or facilitate the emergence of novel species of Agrobacterium spp. The knowledge of the presence of pathogenic and non-pathogenic agrobacteria in galls and host vascular sap can aid in diagnosing the disease pathogen and determining the relative abundance of certain pathogenic species within the galls. Therefore, it is essential to obtain an accurate diagnosis of the pathogenic bacteria of rose crown gall, investigate genetic diversity, and know the pathogenic or non-pathogenic Agrobacterium isolates obtained in rose cuttings and plants imported to the country. During the period of 2021-2023, samples of roses exhibiting symptoms of crown gall were obtained from the greenhouses of Isfahan and Tehran provinces. After the bacteria were isolated from the gall and vascular sap of the samples, all of the isolates were subjected to PCR reaction using the general RGF/RGR primer pair. The isolates that were amplified by a single specific band of 517bp were identified as belonging to the genus Agrobacterium. The genetic fingerprinting of these isolates using BOX1R and ERIC1/ERIC2 primers (rep-PCR) revealed a significant genetic diversity among the 64 isolates examined in this study, which were subsequently categorized into five distinct groups. By comparing the genetic fingerprint pattern of gall isolates and vascular sap related to the same gall sample using the ERIC-PCR test, it was found out that, with the exception of Ag133 (gall) and Ag133s (vascular sap), all other isolates obtained from the gall and vascular sap of the same specimen exhibit a distinct genetic fingerprint pattern. During the pathogenicity test of representative isolates from the rep-PCR groups conducted on carrot discs and stems of pepper, geranium, and tomato plants, it was observed that all isolates, with the exception of Ag108, Ag118, and Ag130, produced gall in their hosts. Using biochemical tests, the majority of the isolates in this study were confirmed to belong to A.tumefaciens biovar 1, although the results of these tests did not align with the grouping of the isolates based on rep-PCR. During PCR reactions using the primer pairs were designed based on the sequence of plasmid gene regions involved in pathogenicity, such as VCF/VCR, VirD2A/VirD2C', and tms2A/tms2B, single nucleotide bands of the expected sizes were amplified in the isolates. However, the Ag130 band failed to specifically amplify the 224bp band (VirD2A/VirD2C'). In the PCR test conducted with a pair of specific primers for opine production, the isolates examined in this research were identified as strains capable of producing nopaline. Phylogenetic analysis of housekeeping genes sequences revealed that the isolate Ag101 is similar to A.rubi, while the representative isolates Ag104 and Ag166 were found similar to G19 and G7 genomvars respectively. The striking conclusion of this study was the significant resemblance observed between the non-pathogenic isolates Ag108 and Ag130 and the Brucella genus.
