توصيفگر ها :
بيوسنتز سيستئين , سرين استيل ترانسفراز , مهندسي متابوليك , گلوتاتيون , تنش هاي اكسيداتيو و فلزي
چكيده فارسي :
آمينواسيد سيستئين، يك آمينواسيد مهم حاوي گوگرد ميباشد كه به طور گسترده در صنايع مختلفي از جمله مواد غذايي، كشاورزي، افزودنيهاي خوراكي، دارويي، آرايشي و بهداشتي استفاده ميشود. سيستئين در بسياري از متابوليت هاي حياتي سلول از جمله ساخت تركيبات حاوي سولفور مانند متيونين، تيامين و كوآنزيم-A به كار رفته است. در افزودني هاي خوراك انسان و دام، سيستئين نقش مهمي در افزايش تعديل ايمني حيوان، رشد حيوانات و افزايش توليد پوست و مو دارد. سيستئين به طور دقيق به عنوان يك آمينواسيد ضروري در رژيم غذايي حيوانات در نظر گرفته نمي‌شود؛ زيرا مي تواند از متيونين سنتز شود، اما در وعده هاي غذايي كه متيونين محدود است، سيستئين بسته به شرايط ضروري ميشود و لذا ممكن است مصرف اين آمينواسيد نيز مانند ديگر آمينواسيدهاي ضروري شود. به دليل اهميت سيستئين و كاربرد بالاي آن در فرآورده‌هاي دارويي، آرايشي و غذايي توليد آن با استفاده از مهندسي متابوليك در ميكرو‌ب‌ها اهميت زيادي پيدا كرده است. در باكتري‌ها سيستئين از آمينواسيد سرين توليد ميشود و در اين مسير ابتدا سرين به او-استيل‌سرين تبديل مي شود و سپس اين ماده حد واسط به سيستئين تبديل ميشود. اين دو واكنش به ترتيب توسط دو آنزيم سرين استيل ترانسفرار (SAT) و سيستئين سنتاز كاتاليز ميشود. در اين مسير آنزيم SAT آنزيم كليدي است چون اين آنزيم تنظيم كننده مسير مي باشد و با افزايش سيستئين معمولا فعاليت آن مهار ميشود. مهار فعاليت آنزيمي SAT در اثر بالا رفتن سيستئين در باكتري‌ها بيشتر گزارش شده و در گياهان كمتر ديده شده است. در اين تحقيق به منظور افزايش سيستئين در باكتري E. coli ژن كد كننده آنزيم SAT از باكتري E. coli به شكل موتاسيون يافته (جايگزيني آمينواسيد متيونين به آمينواسيد آرژنين EcSATm) و ژن كد كننده اين آنزيم از گياه آفتابگردان (HaSAT) سنتز و در وكتور pCDFDuet-1 همسانه سازي شد. وكتور حاصل به باكتري هاي مستعد ساخته شده از باكتري E. coli سويه Rosetta (DE3) انتقال داده شد. پس از القا با IPTG بيان شكل نوتركيب اين دو پروتئين مورد بررسي قرار گرفت. به اين منظور پروتئين كل با استفاده از SDS و پروتئين فاز محلول با استفاده از ليز آنزيمي استخراج شد و بر روي SDS-PAGE ران شدند. باند پروتئين با وزن مولكولي منطبق بر EcSATm و HaSAT بر روي ژل مشاهده شد كه نشان دهنده بيان موفق شكل نوتركيب اين پروتئين‌ها بود. در حاليكه بخش غالب پروتئين EcSATm در فاز محلول باكتري قرار گرفت، بخش قابل توجهي از پروتئئين HaSAT به صورت اجسام متراكم در فاز نامحلول قرار گرفت. مقدار سيستئين در سويه هاي حاصل كه به ترتيب R-EcSATm و R-HaSAT نام گرفت مورد بررسي قرار گرفت. سيستئين يك محصول بيرون سلولي است با اين حال مقدار سيستئين در داخل سلول و خارج سلول اندازه گيري شد. نتايج نشان داد كه بيش بيان اين آنزيم ها در باكتري باعث افزايش معني داري در مقدار سيستئين شده است. با اين حال مقدار سيستئين در محيط كشت خارج سلولي R-EcSATm به طور معني داري بيشتر از R-HaSAT بود؛ اين مقداردر اين سويه به 1572±7.1 ميكروگرم بر ليتر رسيد. با توجه به اينكه سيستئين ممكن است در مسير توليد گلوتاتيون قرار بگيرد مقدار گلوتاتيون هم كه عمدتاً يك محصول داخل سلولي است مورد بررسي قرار‌گرفت. در حاليكه مقدار گلوتاتيون در سويه كنترل 960±23.8 ميكروگرم بر ليتر بود، اين مقدار به ترتيب در دوسويه R-EcSATm و R-HaSAT به 4201±32.4 و 1257±41.89رسيد. با توجه به اينكه افزايش سيستئين و گلوتاتيون مقاومت به تنش ها را افزايش مي دهد اين موضوع با معرض قراردادن سويه هاي نوتركيب جديد در برابر تنش هاي اكسيداتيو و فلزي بررسي شد. نتايج نشان داد كه سويه هاي نوتركيب حاصل و به طور ويژه R-EcSATm مقاومت معني داري نسبت به كنترل نشان داد. نتايج حاصل چشم انداز خوبي براي مهندسي مسير هاي متابوليكي براي افزايش آمينو اسيد سيستئين ايجاد كرد.
چكيده انگليسي :
Cysteine amino acid is an important sulfur-containing amino acid that is widely used in various industries such as food, agriculture, food additives, medicine, cosmetics, and hygiene. Cysteine is used in many vital cell metabolites, including the production of sulfur-containing compounds such as methionine, thiamine, and coenzyme-A. In human and animal feed additives, cysteine plays an important role in increasing animal immunity, animal growth and increasing skin and hair production. Cysteine is not strictly considered an essential amino acid in animal diets; Because it can be synthesized from methionine, but in meals where methionine is limited, cysteine becomes essential depending on the conditions, and therefore the consumption of this amino acid may become essential like other amino acids. Due to the importance of cysteine and its high use in pharmaceutical, cosmetic and food products, its production using metabolic engineering in microbes has become very important. In bacteria, cysteine is produced from the amino acid serine, and in this path, serine is first converted to o-acetylserine, and then this intermediate substance is converted to cysteine. These two reactions are catalyzed by two enzymes, serine acetyltransferase (SAT) and cysteine synthase, respectively. In this pathway, the SAT enzyme is a key enzyme because this enzyme is the regulator of the pathway and its activity is usually inhibited by increasing cysteine. Inhibition of SAT enzyme activity due to increased cysteine has been reported more in bacteria and less in plants. In this research, in order to increase cysteine in E. coli bacteria, the gene encoding the SAT enzyme from E. coli was synthesized in a mutated form (EcSATm replacement M201R) and the gene encoding this enzyme from the sunflower plant (HaSAT) after codon optimization was synthesized and homogenized in the pCDFDuet-1 vector. The resulting vector was transferred to susceptible bacteria made from E. coli strain Rosetta (DE3). After induction with IPTG, the expression of the recombinant form of these two proteins was investigated. For this purpose, the total protein was extracted using SDS and the soluble phase protein was extracted using enzymatic lysis and run on SDS-PAGE. The protein band with the molecular weight corresponding to EcSATm and HaSAT was observed on the gel, which indicated the successful balance of the recombinant form of these proteins. While the dominant part of EcSATm was placed in the soluble phase of bacteria, a significant part of HaSAT protein was placed in the form of inclusion bodies in the insoluble phase. The amount of cysteine in the resulting strains, which were named R-EcSATm and R-HaSAT respectively, was investigated. Cysteine is an extracellular product; however, the amount of cysteine was measured inside and outside the cell. The results showed that the overexpression of these enzymes in bacteria caused a significant increase in the amount of cysteine. However, the amount of cysteine in the extracellular medium of R-EcSATm was significantly higher than that of R-HaSAT. This value was reached in this strain to 1572±7.1 µg/L. Due to the fact that cysteine may be involved in the production of glutathione, the amount of glutathione, which is mainly an intracellular product, was investigated. While the amount of glutathione was in the control strain, this value was reached in R-EcSATm and R-HaSAT strains to 4201±32.4 and 1257±41.89 µg/L respectively. Considering that the increase of cysteine and glutathione increases the resistance to stresses, this issue was investigated by exposing the new recombinant strains to oxidative and metal stresses. The results showed that the resulting recombinant strains and especially R-EcSATm showed significant resistance compared to the control. The results open a new prospect for engineering metabolic pathways to increase the amino acid cysteine
