طراحي و ساخت حسگر زيستي بر پايه كربن جهت تشخيص زودهنگام بيماري ام اس

در حال حاضر بيماري¬ مولتيپل اسكلروزيس (ام اس) يكي از مهمترين بيماري¬هاي مختل كننده¬ي زندگي بيمار به شمارد. روش¬هاي تشخيص رايج اين بيماري ديرهنگام و تهاجمي هستند. استفاده از زيست¬نشانگر سلول‌هاي CD8+T كه در مراحل اوليه در خون و مايع مغزي-نخاعي آزاد مي¬شوند، سرعت تشخيص بيماري را افزايش مي¬دهد و امكان آغاز زودهنگام اقدامات پيشگيرانه براي جلوگيري از پيشرفت بيماري را فراهم مي كند. در بيماري ام اس، سلول‌هاي CD8+T در اطراف غلاف ميلين سلول عصبي افزايش يافته، به آن حمله كرده و در نهايت موجب آسيب آن مي شوند. حسگرهاي تشخيص CD8+T بر پايه فلوسايتومتري و اليزا هستند وگزارش¬هاي بسيار محدودي درباره استفاده از روش هاي الكتروشيميايي براي اين منظور وجود دارد. البته روش الكتروشيميايي نسبت به ساير روش¬هاي فوق در دسترس¬تر و كم¬هزينه¬تر است. هدف از پژوهش حاضر، ساخت و مشخصه يابي حسگر تشخيص سلول‌هاي CD8+T است. در اين پژوهش، طراحي و ساخت حسگر الكتروشيميايي براي شناسايي CD8+T انجام شد. روش الكتروشيميايي روشي نسبتا دقيق، ساده، كاربردي، مقرون به صرفه و كاربرپسند مي¬باشد. پس از انتخاب مواد اوليه، روش لايه نشاني الكترود بررسي شد. زير لايه نانوكامپوزيتي گرافن اكسيد كاهش يافته و پلي پيرول به روش الكتروشيميايي ولتامتري چرخه‌اي سنتز گرديد. سپس الكترود تهيه شده توسط آزمون¬هاي طيف سنجي امپدانس الكتروشيميايي، رامان، طيف زير قرمز، آزمون ترشوندگي و آناليز ميكروسكوپي مورد ارزيابي قرار گرفت. رفتار حسگري الكترود در حضور سلول‌هاي CD8+T با غلظت¬هاي متفاوت از طريق آزمون طيف سنجي امپدانس الكتروشيميايي و ولتامتري پالسي تفاضلي، بررسي شد. نتايج ميكروسكوپي الكتروني روبشي نشان داد كه حسگر ساخته شده‌ داراي يكنواخت‌ترين تركيب نانوكامپوزيتي است كه شامل پلي پيرول‌هاي گل كلمي شكل و صفحات گرافن اكسيد كاهش يافته است. همچنين، اين نانوكامپوزيت در مقايسه با نمونه هاي تهيه شده به روش‌هاي الكتروفورتيك، قطره چكاني و پوشش دهي چرخه‌اي، بيشترين گروه هاي عاملي را دارد. از طرفي تعداد لايه نشاني بهينه‌ي به دست آمده‌ي نانوكامپوزيت داراي مقدار زيادي گروه كربوكسيل است كه براي اتصال به پايانه‌ي نيتروژني آنتي بادي CD8 نياز است و ميتواند مقدار زيادي از آنتي بادي را به سطح الكترود متصل كند. مطابق نتايج، توانايي انتقال بار الكتريكي حسگر به طور قابل توجهي افزايش يافته و مقاومت انتقال بار SPEاز 1948 اهم بر سانتي متر مربع به مقدار 03/11 اهم بر سانتي متر مربع در حسگر ساخته شده كاهش يافته است. در فاز دوم، الكترود تحت آماده سازي نهايي-به ويژه با لايه نشاني آنتي بادي براي ارزيابي‌هاي حسگري- قرار گرفت. مقدار ثابت اتصال به‌دست‌آمده، معادل 14/0K = ، نشان‌دهنده وجود پيوندي با قدرت متوسط تا قوي ميان سلول‌هاي CD8⁺ T و آنتي‌بادي تثبيت‌شده بر سطح الكترود است. حد تشخيص حسگر با روش امپدانس الكتروشيميايي 14 سلول بر ميلي ليتر و با روش ولتامتري پالسي برابر با 22 سلول بر ميلي ليتر به دست آمد. حسگر در غلظتي حدود 500 سلول بر ميلي ليتر به ناحيه اشباع عملكرد فاراديك وارد مي‌شود و از آن نقطه به بعد، پاسخ سامانه وارد ناحيه غيرفاراديك مي‌گردد. همچنين در غلظتي حدود 2000 سلول بر ميلي ليتر، افزايش قابل توجهي Rct در مقاومت مشاهده مي‌شود و در حدود 10000سلول بر ميلي ليتر، نشانه‌هاي ورود به ناحيه اشباع قابل رؤيت است. حساسيت حسگر در محدوده فاراديك mL2cm.Ω 313/0= m به دست آمد. نرخ بازيابي برابر با ٪ 5/97 نسبت به فلوسايتومتري گزارش گرديد. گزينش¬پذيري حسگر ساخته شده در برابر زيست نشانگرهاي CD19، CD4 و CD20 بررسي شد كه با مقدار 05/0<‎ P انتخاب پذيري مناسب حسگر را تاييد كرد. در نتيجه پيوندهاي مولكولي، پديده‌ي تونل‌زني كوانتومي، تعاملات الكترواستاتيكي و تغييرات چگالي الكتروني به‌طور افزايشي عملكرد نانوكامپوزيت‌هاي Ppy/rGO را بهبود مي‌بخشند كه منجر به عملكرد مناسب در كاربردهاي حسگري مي‌شود.

Currently, multiple sclerosis (MS) is considered one of the most significant diseases that disrupt patients’ lives. Existing diagnostic methods are invasive an‎d often performed at advanced stages. The utilization of the CD8+T cells biomarker, which is released into the blood an‎d cerebrospinal fluid at early stages, can accelerate disease diagnosis, allowing patients to initiate preventive strategies against disease progression. In MS, CD8+T cells accumulates around the neuronal myelin sheath, attacks it, an‎d eventually causes damage. Conventional CD8+T cells detection methods rely on flow cytometry an‎d ELISA. However, reports of electrochemical approaches for CD8+T cells detection are very limited, despite the fact that this method is far more accessible an‎d cost-effective compared to the aforementioned techniques. The present study aims to design, fabricate, an‎d characterize an electrochemical CD8+T cells biosensor. Electrochemical techniques are relatively precise, simple, practical, cost-effective, an‎d user-friendly. In this work, a reduced graphene oxide–polypyrrole composite substrate was synthesized using the cyclic voltammetry method. The fabricated electrode was then eva‎luated through electrochemical impedance spectroscopy (EIS), Raman spectroscopy, Fourier-transform infrared (FTIR) spectroscopy, wettability analysis, an‎d microscopic characterization. The sensor’s performance in the presence of CD8+T cells at different concentrations was assessed via EIS measurements an‎d Differential pulse voltammetry (DPV). Among various FESEM fabrication approaches—including electrophoretic deposition, dro‎p-casting, an‎d cyclic coating—the developed biosensor exhibited the most uniform composition an‎d the highest density of functional groups. According to the results, the electrical conductivity of the developed sensor increased significantly, an‎d the charge transfer resistance of the printed electrode decreased from 1948 (Ω·mL·cm⁻²) to 11.03 (Ω·mL·cm⁻²). In the second phase, the electrode underwent final preparation—specifically, antibody coating for sensing eva‎luations. The binding constant value obtained, K = 0.14, indicates a medium to strong binding between CD8⁺ T cells an‎d the antibody immobilized on the electrode surface. The limit of detection (LOD) of the developed electrochemical biosensor with EIS was determined to be 14 (cell.mL -1). The LOD of this biosensor with DPV method is 22 (cell.mL -1). The sensor enters the saturation region of the faradic performance at a concentration of about 500 (cell.mL-1) an‎d from that point onwards, the system response enters the non-faradic region. Also, at a concentration of about 2000 (cell.mL-1), a significant increase in resistance is observed an‎d at about 10000 (cell.mL-1), signs of entering the saturation region are clearly visible. The sensitivity of the sensor in the faradic range was obtained m= 0.313(Ω.cm2.mL). The recovery rate was reported to be 97.5% compared to flow cytometry. selec‎tivity of the biosensor was eva‎luated against the CD19, CD20 an‎d CD4 biomarker, yielding P <‎ 0.05. As a result, molecular bonds, quantum tunneling phenomena, electrostatic interactions, an‎d electron density changes incrementally improve the performance of Ppy/rGO nanocomposites, leading to suitable performance in sensing applications.

شيدا لباف , حميدرضا سليمي جزي

فتح اله كريم زاده

مجيد مقدم , مهران نحوي , كيوان رئيسي