شماره مدرك
21098
شماره راهنما
2490 دكتري
پديد آورنده
زارعي، افسانه
عنوان
ارزيابي پايداري حرارتي آنزيم كيوتيناز براي هيدروليز آنزيمي پلياستر با استفاده از جهشزايي هدايت يافتة مكاني
مقطع تحصيلي
دكتري
گرايش تحصيلي
شيمي نساجي و علوم الياف
محل تحصيل
اصفهان : دانشگاه صنعتي اصفهان
سال دفاع
1404
صفحه شمار
چهارده، 108ص
توصيفگر ها
هيدروليز آنزيمي پلياستر , شبيهسازي ديناميك مولكولي , كيوتيناز , مهندسي پروتئين , پلاسما تخليه ديالكتريك , اصلاح سطح
تاريخ ورود اطلاعات
1405/03/02
كتابنامه
كتابنامه
رشته تحصيلي
مهندسي نساجي
دانشكده
مهندسي نساجي
تاريخ ويرايش اطلاعات
1405/03/17
كد ايرانداك
23219515
چكيده فارسي
باتوجه به مصرف روزافزون پلياستر در صنايع مختلف ازجمله صنعت نساجي و نگرانيهاي گستردهي جهاني پيرامون زيستتخريب ناپذيري اين پليمر، رويكرد اين پژوهش مهندسي نوعي آنزيم استر هيدرولاز از خانوادة كيوتينازها موسوم به LCC باهدف افزايش پايداري حرارتي آن و امكانسنجي استفاده از آن براي هيدروليز سطحي و يا تخريب پلياستر بود. در اين راستا در ابتدا با استفاده از روش داكينگ مولكولي و مولكول C9C ساختار آنزيم/سوبسترا تهيه شد و سپس توسط شبيهسازي ديناميك مولكولي (MD) و آناليز نتايج RMSD و RMSF آمينواسيدهاي كليدي كه در دماي نزديك به دماي انتقال شيشهاي پلياستر بيشترين تأثير را بر ناپايداري حرارتي آنزيم داشتند شناسايي شدند. در نتيجهي اين بررسيها و همترازي توالي نوكلئوتيدي با توالي همولوگهاي اين آنزيم، آمينواسيدهاي T60 موجود در صفحهي β_1 و N122 موجود در حلقهي متصلكنندهي β_4-α_3 به ترتيب با لايزين و ايزولوسين جايگزين شدند. در ادامه مجددا ساختار آنزيم موتانتKI /C9C توسط روش داكينگ مولكولي تهيه شده و تاثير جهشهاي ايجاد شده بر كل پروتئين و بر تكتك آمينواسيدها توسط شبيه سازي ديناميك مولكولي بررسي شد. نتايج نشاندهندهي كاهش RMSD و RMSF در برخي قسمتها بهويژه در نواحي جهش دادهشده بود. سپس توالي نوكلئوتيدي آنزيم اصلاح شده طراحي شده و براي سنتز ارسال شد. آناليز توالييابي سنگر و الكتروفورز ژل آگارز گوياي سنتز صحيح توالي بودند. در ادامه توالي نوكلئوتيدي مذكور به همراه LCC توسط وكتور بياني pET 26b(+) طي فرآيند كلونينگ در باكتري E.Coli BL21 (DE3) بيان و توسط روش IMAC خالصسازي شدند. پس از آن فعاليت 500 ميكروليتر از آنزيمها در 55 درجهسانتيگراد اندازهگيري شد كه به ترتيب µmol/L.min 281/4 و µmol/L.min 014/4 بودند. بررسي دما و pH بهينهي عملكرد آنزيمها توسط سوبستراي مايع پارانيتروفنيل بوتيرات انجام شد. نتايج نشان داد دماي بهينهي عملكرد آنزيم پس از جهش ايجادشده با افزايش 10درجهاي از 55 درجهسانتيگراد به 65 درجهسانتيگراد رسيد درحاليكه pH بهينه براي هر دو آنزيم 8 بود. به علاوه، آنزيم موتانت در دماهاي بالاتر از 70 درجهسانتيگراد نيز به ميزان 5/1 برابر فعاليت بالاتري نسبت به LCC نشان داد. بررسي شاخصهاي سينتيكي V_max و K_m كه به ترتيب براي LCC و KI، µg/ml.min 49/6 و 43/8 و mM 28/0 و 26/0 بودند نشاندهندهي عدم تغيير افينتيه آنزيم نسبت به سوبسترا و افزايش سينتيك واكنش بود. در نهايت عملكرد آنزيمها بر سه نوع سوبستراي پلياستري شامل فيلم پلياستر آمورف (با درجه كريستالينيتي 7%)، نانوالياف پلي كاپرولاكتون (PCL) و الياف پلياتيلنترفتالات با درجه كريستالينيتي 84/35 % بررسي شد. براساس نتايج بهدست آمده، كاهش وزن فيلم پلياستر تيمارشده با KI در 70 درجهسانتيگراد، 33/1 برابر LCC بود. نمونههاي PCL نيز در توسط هر دو آنزيم دماي 50 درجهسانتيگراد تيمارشدند. بررسي مورفولوژي اين نمونهها نشاندهندهي ايجاد نايكنواخي و ناهمواري بيشتر در سطح نانوالياف در پي تيمار با آنزيم KI بود.كاهش وزن نانوالياف تيمارشده با KI نيز به ميزان 4% بيشتر از نانوالياف تيمار شده با LCC بود. زاويه تماس قطره نيز از 04/1± 4/82 در نمونههاي شاهد PCL به 31/1± 6/43 در نانوالياف تيمارشده با LCC و به 57/1± 7/27 در نانوالياف تيمارشده با KI رسيد كه نشاندهندهي بهبود عملكرد آنزيم پس از ايجاد جهش بود در افزايش آبدوستي سطح نانوالياف است. در ادامه، با توجه به بلورينگي بالاي الياف پلياستر، از پيشتيمار پلاسماي تخليه با سد ديالكتريك (DBD) استفاده شد. در اين راهكار، برخلاف پژوهشهاي مشابه، فرايند پيشتيمار پلاسمايي و سپس انكوباسيون در محلول آنزيمي، به 10 سيكل متوالي تقسيم شد تا در هر مرحله، سطح تازهتر و آمادهتري براي تعامل با مولكولهاي آنزيم فراهم گردد. در اين رويكرد، از دو گاز فعال اكسيژن (PO2) و اوزون (PO3) استفاده شد. نتايج بررسيهاي مورفولوژي نشان داد كه آنزيم موتانت KI تأثير بيشتري در تغيير مورفولوژي سطح و ايجاد ناهمواري داشته است. بيشترين تغييرات سطحي در الياف پلياستري مشاهده شد كه پيشتيمار شده با PO3 و سپس با آنزيم KI تيمار شده بودند. همين تيمار كمترين زمان ترشوندگي را نيز به همراه داشت كه نسبت به نمونه شاهد 75٪ كاهش يافته بود. همچنين، كاهش وزن در الياف تيمارشده با آنزيم KI، 1٫5 برابر بيشتر از نمونههاي تيمارشده با آنزيم LCC بود و در اين ميان، گاز اوزون حدود 1٫25 برابر مؤثرتر از اكسيژن عمل كردبررسي تغييرات شيميايي سطح با استفاده از طيفسنجي FTIR-ATR نشاندهنده كاهش شدت پيك كربونيل و افزايش پيكهاي مربوط به گروه هيدروكسيل در نواحي cm⁻¹ 1100 و cm⁻¹ 972 بود. ...
چكيده انگليسي
Considering the ever-increasing use of polyester in various industries, including the textile industry, and the widespread global concerns about the non-biodegradability of this polymer, the approach of this research was to engineer a type of ester hydrolase enzyme from the cutinase family, known as LCC, with the aim of enhancing its thermal stability and assessing its feasibility for surface hydrolysis or degradation of polyester. In this regard, first, the enzyme/substrate structure was prepared using molecular docking with the C9C molecule, and then key amino acids that had the greatest impact on the enzymeʹs thermal instability at temperatures near the glass transition temperature of polyester were identified through molecular dynamics simulation (MD) and analysis of RMSD and RMSF results. As a result of these analyses and nucleotide sequence alignment with homologous sequences of this enzyme, the amino acids T60 located on the β₁ sheet and N122 located in the β₄-α₃ connecting loop were replaced with lysine and isoleucine, respectively. Subsequently, the structure of the mutant enzyme KI/C9C was again prepared using molecular docking, and the effects of the introduced mutations on the entire protein and on individual amino acids were examined through molecular dynamics simulation. The results indicated a reduction in RMSD and RMSF in certain regions, particularly around the mutated sites. The nucleotide sequence of the engineered enzyme was then designed and sent for synthesis. Sanger sequencing analysis and agarose gel electrophoresis confirmed the correct synthesis of the sequence. Subsequently, this nucleotide sequence, along with LCC, was cloned into the pET 26b (+) expression vector, expressed in E. coli BL21 (DE3), and purified using the IMAC method. Afterwards, the activity of 500 microliters of the enzymes was measured at 55°C, which was 4.281 µmol/L•min and 4.014 µmol/L•min, respectively. The optimum temperature and pH for enzyme performance were determined using liquid p-nitrophenyl butyrate as the substrate. The results showed that the optimum operating temperature of the enzyme after mutation increased by 10°C from 55°C to 65°C, while the optimum pH for both enzymes was 8. In addition, the mutant enzyme showed 1.5 times higher activity than LCC at temperatures above 70°C. Examination of the kinetic parameters Vmax and Km, which were 6.49 and 8.43 µg/mL.min, and 0.28 and 0.26 mM for LCC and KI respectively, indicated no change in the enzymeʹs affinity for the substrate and an increase in reaction kinetics. Finally, the performance of the enzymes was evaluated on three types of polyester substrates: amorphous polyester film (with 7% crystallinity), polycaprolactone (PCL) nanofibers, and polyethylene terephthalate fibers with 35.84% crystallinity.
According to the obtained results, the weight loss of the polyester film treated with KI at 70°C was 1.33 times that of LCC. PCL samples were also treated with both enzymes at 50°C. Morphological examination of these samples showed greater non-uniformity and surface roughness in the nanofibers following treatment with the KI enzyme. The weight loss of nanofibers treated with KI was also 4% greater than that of nanofibers treated with LCC. The contact angle also decreased from 82.4 ± 1.04° in the control PCL samples to 43.6 ± 1.31° in LCC-treated nanofibers and to 27.7 ± 1.57° in KI-treated nanofibers, indicating improved enzyme performance after mutation in enhancing the surface hydrophilicity of the nanofibers. ......
.
استاد راهنما
فرزانه علي حسيني
استاد مشاور
فرزانه جعفري
استاد داور
اكبر خدامي , حميد زيلوئي , شهرزاد آهنگرزاده