8759

8120

كارشناسي ارشد

بيوتكنولوژي

اصفهان: دانشگاه صنعتي اصفهان، دانشكده كشاورزي

1392

پانزده،105ص.: مصور،جدول،نمودار(رنگي)

ص.ع.به فارسي و انگليسي

آذرشاه پيري، محمدعلي اسداللهي

2/2/93

مسعود بهار، مهدي رحيم ملك

مهندسي كشاورزي

ID8120

چكيده ترپنوئيدها دسته ي متنوعي ز متابوليتهاي ثانويه هستند كه بي پانزدهدر بافتهاي گياهي به عنو ن جز صلي روغنهاي ضروري شتر يافت ميشوند به دليل كاربرد گسترده ين تركيبات در صنايع د رويي آر يشي و غذ يي توليد ميكروبي ين تركيبات خير بسيار مورد توجه قر ر گرفته ست مخمر ساكارومايسس سرويزيه به دليل وجود مسير مو لونات به طور طبيعي حاوي پيش ماده ضروري سنتز ترپنوئيدها IPP ست و ز ين رو پتانسيل توليد بسياري ز ترپنوئيدها ر د رد ما به دليل ختصاص قسمت عظم IPP موجود در سلول به سنتز رگوسترول محصول نهايي مسير مو لونات و بنابر ين كمبود IPP آز د درون سلولي بيان دگر ساخت ترپنوئيدها به سنتز مقد ر بسيار كمي ز آنها در سلولهاي مخمر مي نجامد فز يش IPP آز د درون سلولي عمدتا ز طريق فز يش فعاليت آنزيمهاي كليدي موجود در مسير و جلوگيري ز مصرف آن در ر ه توليد رگوسترول ميسر ميشود آنزيم HMG COA ردوكتاز يكي ز آنزيمهاي كليدي مسير مو لونات ست و بنابر ين بالا رفتن ميز ن آن درسلول ميتو ند يكي ز ر هكارهاي فز يش IPP باشد ز سوي ديگر مهار ژن 9 ERG كد كننده آنزيم سكو لن ز طريق كاهش پيش ساز سنتز رگوسترول مانع ز تخصيص IPP ھاي موجود در سلول جهت سنتز رگوسترول ميگردد و بدين ترتيب محتوي IPP آز د درون سلول ر بالا ميبرد لينالول يك مونوترپنوئيد غير حلقوي معطر ست كه در بسياري ز گياهان گلد ر و گونههاي گياهي يافت ميشود ين مونوترپنوئيد علاوه بر كاربرد در صنايع آر يشي و بهد شتي در درمان بيماريهايي مثل لوسمي و سرطان سينه نيز به كار ميرود هدف ز ين تحقيق تعيين ثر بيش بيان قسمت كاتاليتيك ژن 1 HMG ژن كد كننده آنزيم HMG COA ردوكتاز و مهار ژن 9 ERG بر روي توليد لينالول و ز ين طريق دستيابي به سويه ي مخمري باقابليت توليد بالاي لينالول ست در جر ي ين تحقيق بتد قسمت كاتاليتيك ژن 1 tHMG1 HMG تحت كنترل پروموتور 01 GAL در ناقل بي اني pESC URA همسانه سازي شد پس ز آن با همسانه سازي ژن لينالول سنتاز LIS با ستفاده ز تكنيك Gap repair در ناقل مذكور سازو ره pESCURA HMG LIS يجادگرديد به منظور بررسي ثر بيش بيان ژن 1 tH MG سازو ره pESCURA LIS نيز ساخته شد نتقال ين دو سازو ره به دو سويه 9 ERg و 5D منجر به يجاد 4 سويه 5D pESC HMG 5D pESC LIS ERG9 pESC HMG LIS ERG9 pESC LIS LIS گرديد جهت يافتن زمان مناسب بر ي نمونهبرد ري و ستخر ج لينالول توليد شده در كشت سلولي مورد ستفاده منحني رشد سويههاي موجود رسم شد پس ز ستخر ج لينالول با ستفاده ز روش ستخر ج فاز جامد ميز ن سنتز لينالول طي آناليزكروماتوگر في گازي GC محاسبه گرديد بيش بيان ژن 1 tHMG ز طر ي ق بالابردن م ي ز ن IPP موجود در سلول و به بيان ديگر رفع محدوديت كمبود IPP در سلول باعث بالا دو بر بر شدن ميز ن سنتز لينالول در 5D pESC HMG LIS نسبت به سويه 5D pESC LIS شد مشاهده ميز ن لينالول توليدي توسط دو سويه ERG9 pESC LIS و ERG9 pESC HMG LIS نشان ميدهد كه بيش بيان ژن 1 tH MG تغيير چند ني درميز ن سنتز لينالول يجاد نكرد كه حتمالا ناشي زفعال شدن سيستم تنظيم بازخوري سلول و توليد تركيبات جانبي به دنبال مهار ژن 9 ERG ست به طور كلي مقايسه غلظت لينالول در سويههاي موجود نشان د د كه در دو سويه ERG9 pESC LIS ERG9 pESC HMG LIS سنتز لينالول به مر تب بالاتر ز دو سويه ديگر ست ين مشاهد ت بيانگر ين ست كه كاهش تخصيص IPP هاي درون سلولي جهت سنتز رگوسترول وتغيير مسير متابوليسمي به سمت سنتز لينالول تأثير بيشتري ر نسبت به

108 Overexpression of HMG CoA Reductase Coding Gene to EnhanceHeterologous Production of Linalool in the Yeast Saccharomyces cerevisiae Pegah amiri Pamiri64@yahoo com January 15 2014 Department of Agricultural Biotechonolgy Isfahan University of Technology Isfahan 84156 83111 IranDegree M Sc Language farsiA Shahpiri Assist Professor a shahpiri@cc iut ac irM A Asadollahi Assist Professor masadollahi@yahoo comAbstractTerpenoids are a group of secondary metabolites that usually exist in herbal tissues as the main components ofessential oils Due to their wide use in pharmaceutics cosmetics and food industry these compounds have attractedgreat attention recently Saccharomyces cerevisiae naturally contains the necessary precursors for the synthesis ofterpenoids and therefore can be used as a cell factory for heterologous production of these compounds However major portion of the available isopenthenyl pyrophosphate IPP as the main precursor for the biosynthesis ofterpenoids in the cell is consumed for the synthesis of ergosterol the final product of mevalonate pathway Therefore the lack of free IPP in the cell limits the amount of the heterologous production of terpenoids in the cells To increase the amount of free IPP in the cell the key enzymes in the mevalonate pathway need to be regulated HMG COA reductase is one of the key enzymes in the mevalonate pathwaywhich catalyzes a limiting step in thepathway Overexpression of HMG1 which encodes this enzyme is expected to improve the available IPP for thebiosynthesis of terpenoids By downregulation of ERG9 encoding squalene synthase it is also possible to reducethe flux of IPP towards ergosterol Linalool is an acyclic aromatic monoterpene which exists in many plants Thismonoterpen can be used in cosmetics and hygienic products and also treatment of diseases such as breast cancer andleukemia The aim of the current study was to examine the influence of overexpression of HMG1 catalytic domainand repressiom of ERG9 and therefore obtaining a yeast strain with high linalool production ability To this end HMG1 catalytic domain was cloned in pESC URA expression vector under the control of GAL10 promoter Thenby cloning linalool synthase gene LIS through gap repair technique in the vector pESC URA HMG1 LISconstruct was obtained As a control pESC URA LIS vector was also constructed By transforming these vectorsinto wild type yeast CEN PK 113 5D and ERG9 downregulated yeast strain 5D pESC LIS 5D pESC HMG LIS ERG9 pESC LIS and ERG9 pESC HMG LIS strains were constructed After extracting linalool fromculture medium by using solid phase extraction SPE method the amount of the linalool was determined byanalyzing with gas chromatography GC Overexpression of HMG1 doubled the amount of linalool in 5D pESC HMG LIS compared to 5D pESC LIS However overexpression of HMG1 in the ERG9 pESC LIS strain did notimprove the amount of the linalool synthesis which is likely due to the activation of the feedback inhibition andproduction of byproducts following ERG9 repression Therefore ERG9 pESC LIS and 5D pESC HMG LISproduced the highest amounts of linalool Rep ressio n of ERG9 also improved linalool production by three fold These observations indicate that by manipulating the key enzyme in the mevalonate pathway it is possible toconstruct linalool overproducer yeast strains Keywords terpenoids Saccharomyces cerevisiae overexpression Linalool Gas Chromatography

آذرشاه پيري، محمدعلي اسداللهي

مسعود بهار، مهدي رحيم ملك