10164

9382

كارشناسي ارشد

بيوتكنولوژي

اصفهان: دانشگاه صنعتي اصفهان، دانشكده كشاورزي

1393

پانزده،81ص.: مصور، جدول، نمودار

ص.ع. به فارسي و انگليسي

آذرشاهپيري

آقافخرميرلوحي

10/3/94

مسعود بهار، جهانگير خواجه علي

1396/10/02

كتابنامه

كشاورزي

مهندسي كشاورزي

ID9382

چكيده متالوتيونينها MTs يك خانواده پروتئيني با وزن مولكولي پايين و غني از سيستئين هستند كه در گياهان جانوران قارچها و سيانوباكتري ها يافت مي شوند در گياهان اين خانواده پروتئيني نقش مهمي در هموستازي فلزات از طريق اتصال به فلزات به عهده دارند اخيرا نقش اين پروتئينها در محافظت سلول در برابر استرسهاي اكسيداتيو نيز گزارش شده است با اين حال مكانيسم عمل اين خانواده پروتئيني در پاكسازي گونه هاي واكنش گر اكسيژني هنوز به طور واضح مشخص نمي باشد بنابراين در اين مطالعه هدف بررسي تاثير ايزوفرم هاي مختلف MT گياهي بر فعاليت آنزيم كاتالاز CAT و سوپراكسيد ديسموتاز SOD به عنوان دو آنزيم آنتي اكسيدان مهم در موجودات زنده بود قبلا چهار ايزوفرم مختلف MT از گياه برنج به نام 1 OsMT3 OsMT2 OsMT و 4 OsMT كه به ترتيب به تيپ 1 2 3 و 4 تعلق داشتند به صورت هترولوگ در باكتري E coli به همراه شريك الحاقي با GST توليد شدند در اين مطالعه به منظور بررسي نقش MT در ايجاد مقاومت به استرسهاي اكسيداتيو سويه هاي توليد كننده اين چهار ايزوفرم مختلف در محيط كشت حاوي 1 3 ميلي مولار پراكسيد هيدروژن و 4 6 درصد اتانول رشد داده شدند القا كننده IPTG جهت القاي پروموتر به منظور بيان پروتئين ها به محيط كشت اضافه شد منحني رشد اين سويه ها به همراه منحني رشد سويه شاهد كه فاقد ژن MT بود و فقط GST توليد مي كرد رسم شد منحني هاي رشد نشان داد سويه هاي توليد كننده ايزوفرم هاي مختلف MT مقاومت بالاتري در شرايط استرس نسبت به سويه شاهد دارند فعاليت CAT و SOD نيز در اين سويه ها مورد اندازه گيري قرار گرفت فعاليت اين دو آنزيم در همه سويه هاي توليد كننده MT نسبت به فعاليت اين دو آنزيم در سويه هاي شاهد بالاتر بود كه اين موضوع نشان دهنده تاثير بيان هترولوگ MT در فعاليت اين دوآنزيم مي باشد همچنين فعاليت آنزيم CAT در سويه هاي بيان كننده ايزوفرم هاي مختلف MT متفاوت بود كه اين موضوع مي تواند نشان دهنده تاثير متفاوت ايزوفرم هاي مختلف MT باشد تاثير MT بر فعاليت دو آنزيم CAT و SOD در محيط اين ويترو نيز مورد مطالعه قرار گرفت بدين منظور پروتئين هاي 3 Zn2 OsMT و 3 Fe2 OsMT با رشد سويه توليد كننده در محيط كشت حاوي 2 Zn يا 2 Fe و با اضافه كردن IPTG توليد شد با توجه به حضور His Tag در اين پروتئينها با استفاده از كروماتوگرافي جذبي خالص سازي آنها انجام شد از طرفي ديگر سويه شاهد در محيط حاوي پراكسيد هيدروژن رشد داده شد و پروتئين محلول كل از اين باكتري استخراج شد فعاليت CAT و SOD در اين پروتئين كل يك بار بدون اضافه كردن MT و بار ديگر با اضافه كردن Zn2 MT و Fe2 MT اندازه گيري شد نتايج نشان داد كه بر خلاف Zn2 MT كه تاثيري بر فعاليت CAT نداشت فعاليت اين آنزيم به طور قابل توجهي در حضور Fe2 MT بالا رفت فعاليت آنزيمي SOD نيز در حضور 2 Zn MT افزايش يافت اين نتايج نشان مي دهد كه دليل افزايش فعاليت دو آنزيم CAT و SOD شايد اين باشد كه پروتئين هاي Zn2 MT و Fe2 MT به ترتيب

The Effect of Heterologous Expression of Three Isoforms of Rice Oryza sativa Metallothionein on The Tolerance of Escherichia coli to Oxidative Stresses Sayed Reza Deljoonia Rezadeljoonia@yahoo com January 11 2015 Department of Agricultural Biotechnology Isfahan University of Technology Isfahan 84156 83111 IranDegree M sc Language FarsiSupervisor A Shahpiri a shahpiri@cc iut ac irAbstractMetallothioneins MTs are an superfamily of low molecular weight cysteine Cys rich proteins present in plants animals fungi and cyanobacteria In plants MTs are suggested to be involved in metal tolerance or homeostasis asthey are able to bind metal ions through the thiol groups of their cysteine residues Recent reports show that MTs arealso involved in the scavenging of reactive oxygen species ROS However the mechanism that MTs regulate ROSis not still completely clear Therefore in this work the activities of catalase CAT and superoxide dismutase SOD as two main antioxidant enzymes in Escherichia coli were studied in the presence of different plant MT isoforms Previously four rice Oryza sativa MT isoforms OsMTI OsMTI 2a OsMTI 3a and OsMTII 1a that belong to type1 type 2 type 3 and type 4 respectively were heterologously expressed in Escherichia coli as carboxyl terminalextensions of glutathione S transferase GST The four strains expressing these 4 isoforms were grown in LB mediumcontaining 1 3 mM hydrogen peroxide or 4 6 ethanol The tolerance of cells expressing recombinant proteins werecompared to control strain The strain that produce GST by plotting their growth curve The results showed that thetolerance of bacteria expressing MT is considerably more than that in control strain suggesting the role of heterologousexpression of plant MTs in tolerance of bacteria against oxidative stress The activities of catalase and SOD in thestrains expressing MTs as well as control strain were determined The enzyme assay showed that the activities of bothCAT and SOD in strains expressing MTs were higher than that in control strain However the activity of CAT differsin different strains which may indicate that different MT isoforms have different effects on the activity of CAT Inaddition In vitro study of the effect of MT isoforms on CAT and SOD activities were analyzed To this end therecombinant Zn2 MT and Fe2 MT were expressed by addition of either Zn2 or Fe2 20 min after addition of IPTGto the transgenic strains The soluble proteins were extracted 4h after addition of IPTG and were purified using affinitychromatography Then the pure MTs were added to total protein which was extracted from control strain and then theactivities of CAT and SOD were analyzed The results show that while the activity of SOD was increased in thepresence of Zn2 MT the activity of CAT was not changed However the activity of CAT increased in the presence ofFe2 MT Therefore the results suggest that MTs play important role as supplier of Fe2 and Zn2 for CAT and SOD respectively Keywords metallothionein oxidative stresses enzymatic antioxidants ROS

آذرشاهپيري

آقافخرميرلوحي

مسعود بهار، جهانگير خواجه علي