توليد فرم نوتركيب برازئين به عنوان يك شيرين كننده پروتئيني در باكتري اشرشياكولاي

چكيده فارسي :

چكيده امروزه انسانهاي زيادي در سراسر جهان از بيماريهاي چاقي مقاومت انسولين و ديابتهاي نوع رنج ميبرند شكر محبوبترين شيرين كننده در مواد غذايي است كه به دليل داشتن كالري باال با ايجاد اين بيماريها در ارتباط ميباشد بنابراين پيدا كردن جايگزينهاي سالم و مقرون به صرفهتر نسبت به قندها و شيرين كنندههاي مصنوعي افزايش قابل توجهي يافته است و تقاضا براي شيرين كنندههاي مبتني بر پروتئين غير كالريزا با خواص طعم مطلوب باالست تا كنون هشت پروتئين شيرين و از جمله برازئين واقع در ميوهي گياه آفرقايي Pentadiplandra brazzeana شناسايي شده اند خصوصياتي مانند شيريني ثبات حرارتي حالليت آبي حداقل وزن مولكولي و خواص طعمي شبيه شيرين كنندههاي كربوهيدراتي در حال حاضر برازئين را به شيرين كنندهي پروتئيني برتر تبديل كرده است در اين تحقيق هدف ما توليد برازئين در E coli به عنوان پروتئين الحاقي با His tag است بنابراين توالي ژن كد كنندهي برازئين در pET28a همسانهسازي شد و دستواره توليدي pET28a braz به E coli سويه 3 Rosetta DE انتقال يافت به دنبال القا توسط IPTG پروتئين His Braz در E coli بيان شد با اينحال درصد زيادي از پروتئين در فاز نامحلول يافت شد و براي حل اين مشكل ما تصميم به بيان پروتئين به عنوان يك قسمت الحاقي به انتهاي كربوكسيلي از GST tag گرفتيم بررسي پروتئينهاي كل محلول و نامحلول نشان داد كه برچسب GST منجر به يك افزايش 04 درصدي حالليت شد هر دوي His Braz و GST Braz با استفاده از كروماتوگرافي تمايلي خالصسازي شدند و متوجه شديم كه غلظت بر حسب موالر و عملكرد نهايي GST Braz پروتيين خالص توليد شده از يك ليتر محيط كشت 215 و 0023 برابر بيشتر از His Braz بودند اما با توجه به اثر منفي برچسبهاي انتهاي آمينو بر روي شيريني برازئين حذف GST tag با استفاده از آنزيم انتروكيناز انجام شد بررسي محصول برش يافته بر روي Tricine SDS PAGE نشان دهنده برش آنزيمي موثري بود با اينحال چالش هزينه آنزيم در توليد مقياس باالي برازئين يك مشكل مهم در استفاده از سيستم GST braz بود بنابراين توليد برازئين در سيستم يوكاريوتي همچون مخمر ساكارومايسس سرويزيه به عنوان مرحلهي ديگري در اين پروژه انجام شد بدين منظور ژن كد كنندهي برازئين در يك ناقل با پروموتر GPD همسانهسازي شد دستواره GPD braz به سويه 5D از مخمر انتقال يافت و بيان برازئين در ساكارومايسس سرويزيه بعد از بررسي پروتئين كل بر روي Tricine SDS PAGE تاييد شد با اينحال حالليت و شيريني پروتئين نياز به بررسي در آينده دارد كلمات كليدي پروتئين شيرين برازئين شريك الحاقي GST آنزيم انتروكيناز Tricine SDS PAGE

كاظمي نسب، اكرم

توليد فرم نوتركيب برازئين به عنوان يك شيرين كننده پروتئيني در باكتري اشرشياكولاي

پروتئين شيرين , برازئين , شريك الحاقي GST , آنزيم انتروكيناز , Tricine-SDS-PAGE