پديد آورنده :
مجنون، زهرا
عنوان :
همسانه سازي و بيش بيان ژن كد كننده كرومات ردوكتاز (YieF) در باكتري اشريشياكلي
مقطع تحصيلي :
كارشناسي ارشد
گرايش تحصيلي :
بيوتكنولوژي
محل تحصيل :
اصفهان : دانشگاه صنعتي اصفهان
صفحه شمار :
دوازده، 66ص.: مصور، جدول، نمودار
استاد راهنما :
اذر شاهپيري
استاد مشاور :
اقافخر ميرلوحي، رحيم مهرابي
توصيفگر ها :
فلزات سنگين , كروم , متالوتيونين , كرومات ردوكتاز , بيان پروتئين
استاد داور :
بنفشه خليلي، ابوذر سورني
تاريخ ورود اطلاعات :
1398/07/07
تاريخ ويرايش اطلاعات :
1398/07/08
چكيده فارسي :
چکیده کروم یک فلز سمی با درجه اکسیداسیون 2 6 است با این حال Cr VI و Cr III دو شکل رایج اکسیداسیون کروم در محیط هستند ترکیبات ساخته شده از Cr VI به طور کلی دارای حاللیت بیشتر و در نتیجه حرکت بیشتر در محیط زیست در مقایسه با ترکیبات Cr III هستند عالوه بر این Cr VI یک فلز سرطان زا است که منجر به مشکالتی مانند سوزش پوست آلرژی و سرطان ریه در ا نسان هایی که در معرض این فلز هستند شده است برای حذف کرومات 6 Cr از محیط زیست تا کنون روش های مختلف شیمیایی و فیزیکی به کار برده شده است با این حال نیاز به انرژی باال حذف ناقص فلزو تولید لجن سمی از معایب این فنا وری ها است در سال های اخیر زیست پاالیی به یکی از روش های جایگزین تبدیل شده است که به دلیل راندمان باال هزینه های پایین و ماهیت سازگاری آن با محیط زیست از جذابیت باالیی برخوردار است از این رو تبدیل 6 Cr به 3 Cr غیر سمی با استفاده از باکتری های مقاوم به کروم گزینه ای مقرون به صرفه می باشد در این تحقیق یک ژن کدکننده کرومات ردوکتاز به نام YieF از ژنوم E coli با استفاده از PCR تکثیر شد سپس محصول PCR در وکتور pCDFduet تحت پروموتر 7 T همسانه سازی شد و به باکتری میزبان Rosetta 3 DE منتقل شد سویه حاصل R YieF نامگذاری شد القائ باکتری با IPTG منجر به تولید YieF به صورت یک پروتئین همراه با شریک الحاقی His tag شد بررسی حاللیت پروتئین نشان داد که مقدار قابل توجهی از پروتئین در فاز محلول پروتئین یافت می شود مقایسه ی منحنی رشد و تعیین مقدار 6 Cr حذف شده در محیط R YieF و سویه شاهد نشان داد که بیش بیان YieF اثر قابل توجهی بر تجمع 6 Cr دارد عالوه بر این در این تحقیق ژن کد کننده یکی از ایزوفرم های برنج به نام 1 OsMT که قبال در وکتور pET41a همسانه سازی شده بود و قابلیت جذب 6 Cr را داشت به طور همزمان با YieF بیان شد Co expression بدین منظور دستواره 1 pET41a OsMT در سویه R YieF ترانسفورم شد و سویه R MT YieF ساخته شد استخراج پروتئین از این سویه و ران بر روی ژل SDS PAGE بیان همزمان دو پروتئین YieF و1 OsMT را تایید می کرد در نهایت منحنی رشد سویه های1 R YieF MT1 R YieF R MT و سویه شاهد در مقایسه با سویه ها در محیط کشت در حضور 2 میلی موالر 6 Cr مقایسه شد نتایج نشان می دهد که OD پس از 21 ساعت در تمام سه گونه تراریخته بیشتر از شاهد بود تجمع 6 Cr در سویه های جدید و همچنین کنترل در طول 0 2 6 و 01 ساعت بعد از افزودن IPTG و 6 Cr تعیین شد نتایج نشان داد که انباشت 6 Cr در سویه های تراریخته بیشتر از سویه شاهد می باشد به طوریکه بعد از 21 ساعت مقدار انباشت 6 4 98 7 10 Cr و 9 2به ترتیب در سویه های R R YieF MT R MT1 YieF و سویه شاهد بود که نشان دهنده اثر قابل مالحظه بیان همزمان1 OsMT و YieF در حذف 6 Cr است ایزوترم جذب نشان داد که مقدار تجمع 6 Cr در سویه R MT1 YieF وابسته به غلظت اولیه 6 Cr می باشد با این حال جذب ثابت باقی ماند زمانی که غلظت اولیه به 3 میلی موالر رسید واژگان کلیدی فلزات سنگین کروم متالوتیونین کرومات ردوکتاز بیان پروتئین
چكيده انگليسي :
Cloning and overexpression of gene encoding chromate reductase YieF in Escherichia coli Zahra Majnoon Zahramajnoon6292@gmail com May 13 2019 Department of Biotechnology College of Agriculture Isfahan University of Technology Isfahan 84156 83111 Iran Degree M Sc Language Farsi Supervisor Azar Shahpiri a shahpiri@cc iut ac irAbstractChromium is a toxic metal with oxidation numbers ranging from 2 to 6 Nonetheless Cr VI and Cr III are two commonly existing stable oxidation states of chromium in the environment The Cr VI made compounds are generally more soluble mobile and bioavailable in the environment in comparisonwith Cr III made compounds Besides chromium VI is a notorious inhaled carcinogen and leads tosevere health problems ranging from simple skin irritation to lung carcinoma The elimination ofchromium from the environment can be achieved by dint of various chemical and physical approaches However the high energy demands incomplete elimination production of toxic sludge are some ofdisadvantages of these technologies In recent years bioremediation has become one of the alternativemethods which are of broad appeal through people owing to its high efficiency low cost and itsecofriendly nature Hence the transformation of Cr VI to the non toxic Cr III using chromiumresistant bacteria offers an affordable and cost effective option concerning chromate detoxification In thepresent work a gene encoding a chromate reductase named YieF was overexpressed in E coli To thisend the gene encoding YieF was amplified from the genome of E coli by PCR Then the PCR productwas cloned in the expression vector pCDFduet under the promoter T7 The construct pCDFduet YieF wastransformed in E coli strain Rosetta DE3 resulted in production of a new strain named R YieF Theheterologous expression of YieF as a His tag fusion protein was confirmed in the soluble fraction of E coli by SDS PAGE The comparison of growth curve and determination of the amount of eliminated Cr 6 in the medium of R YieF and the control strain showed that the over expression of YieF has a significanteffect on the accumulation of Cr6 In addition we co expressed YieF with a rice metallothionein isoform OsMT1 in E coli Therefore the construct PCDFduet YieF together with the previous made constructpET41a OsMT1 were transformed in E coli strain Rosetta DE3 The new strain was named R YieF MT1 The heterologous expression of both His YieF and GST OsMT1 were confirmed in the solublefraction of this strain Finally the growth curve of the strains R MT1 R YieF R YieF MT1 and controlstrain was compared when the strains were grow up in the medium in the presence of 2 mM Cr 6 Theresults show that the OD after 12 h in the all three transgenic strain was more than control strain Theaccumulation of Cr6 in the new strains as well as control was determined during 0 2 6 and 10 h afteraddition of IPTG and Cr6 to the medium The results showed that the accumulation of Cr 6 increase in thestrains during time However the amount of accumulation between strains are different and is in order ofR MT1 YieF R YieF R MT1 Control which indicate the significant effect of co expression of MT1and YieF in the elimination of Cr6 The absorption isotherm showed amount of accumulation of Cr 6 inthe strain R MT1 Yied is dependent on the primary concentration of Cr6 However the absorption wasremained constant when the primary concentration was reached to 3 mM Keywords heavy metals chromium metallothionein chromate reductase protein expression 67
استاد راهنما :
اذر شاهپيري
استاد مشاور :
اقافخر ميرلوحي، رحيم مهرابي
استاد داور :
بنفشه خليلي، ابوذر سورني
