توصيفگر ها :
سوپراكسيد ديسموتاز , هيدروژل , تحويل دارو , گونه هاي فعال اكسيژن , سميت زدايي اكسيداتيو , لاين سلولي فيبروبلاست موش
چكيده فارسي :
گونه¬هاي فعال اكسيژن همواره به عنوان فراورده جانبي در واكنش¬هاي طبيعي سلول¬هاي هوازي، سلامت سلول¬ها را تهديد مي¬كنند. اين گروه از مولكول¬ها شامل اكسيژن منفرد، راديكال سوپراكسيد و هيدروژن¬پراكسيد در بخش¬هاي مختلف سلول، به¬خصوص در ميتوكندري توليد شده و با اثر مستقيم بر بيومولكول¬هاي حياتي از جمله پروتئين¬ها، نوكلئيك اسيد و ليپيدهاي غشايي سلامت سلول، بافت، ارگان و در نهايت جاندار را به¬خطر مي¬اندازند. بيماري¬هاي متعددي در رابطه با ROSها وجود دارند كه همچنان يافتن رويكردهاي نوين درماني براي آن¬ها موضوع پژوهش¬هاي بسياري است. از جمله اين بيماري¬ها مي¬توان به آلزايمر، بيماري¬هاي تحليل رونده اعصاب و زخم¬هاي مزمن اشاره كرد. در سلول¬هاي هوازي طي ساليان متمادي تكامل، سيستم¬هاي آنتي¬اكسيداني طبيعي شامل آنتي¬اكسيدان¬هاي آنزيمي و غير آنزيمي توسعه يافته¬اند كه با كنترل سطوح ROSها، سلامت سلول را تضمين مي¬كنند. ازجمله مهمترين اين آنتي¬اكسيدان¬ها، آنزيم¬هاي سوپراكسيد ديسموتاز هستند كه به¬شكل موثري در حذف راديكال¬هاي سوپراكسيد در سلول عمل مي¬كنند. در اين پژوهش از SODهاي نوتركيب گياه حرا استفاده شد. اين آنزيم¬ها شامل AmSOD1 و AmSOD2 هستند كه هركدام به¬ترتيب نوعي CuZnSOD و MnSOD مي¬باشند. اين دو آنزيم در مقايسه با ساير آنزيم¬هاي SODي موجود فعاليت و پايداري بالاتري دارند، به همين دليل گزينه¬هاي مناسبي براي درمان بيماري¬ها بر مبناي افزابش بيش از حد ROS به¬نظر مي¬رسيدند. اين دو آنزيم به¬صورت هترولوگ در باكتري E.coli و ميزبان بياني Rosetta(DE3) بيان شدند سپس مراحل خالص¬سازي، دياليز و تعيين فعاليت روي آن¬ها صورت گرفت. در ادامه اين آنزيم¬ها به لاين سلولي فيبروبلاست موش بدون اعمال استرس اكسيداتيو افزوده شدند تا اثر هر آنزيم بر زنده¬ماني اين سلول¬ها مشخص شود. سپس در نتيجه واكنش بين زانتين و زانتين اكسيداز در لاين سلولي، راديكال سوپراكسيد توليد شده و باعث ايجاد استرس اكسيداتيو شد. در ادامه غلظت¬هاي 5 و 25 ميكروگرم از دو آنزيم AmSOD1 و AmSOD2 به لاين سلولي فيبروبلاست دچار استرس اكسيداتيو افزوده شد. نتايج آزمايش¬هاي سلولي نشان داد كه افزودن آنزيم¬هاي نوتركيب SOD به لاين سلولي فيبروبلاستي اثر منفي بر رشد و تكثير سلول¬ها ندارد. در شرايط استرس اكسيداتيو، زنده¬ماني سلولهاي فيبروبلاست به شدت كاهش يافت. در حالي¬كه افزودن اين آنزيم¬ها به لاين سلولي ، باعث كنترل اين استرس شده و زنده¬ماني سلول¬ها دوباره به حال عادي پيش از استرس بازگشت. پس از اثبات ويژگي دارويي اين آنزيم¬ها، تركيبات هيدروژل متعددي براي توسعه نانوساختار تحويل مناسب اين آنزيم¬ها به زخم مزمن مورد برسي قرار گرفتند. هيدروژل¬هاي تركيبي با استفاده از دو پليمر PVA و كيتوسان با نسبت برابر و با استفاده از چرخه ذوب و انجماد پياپي به عنوان عامل اتصال عرضي ساخته شدند. اين هيدروژل¬ها از نظر ويژگي¬هاي فيزيكي و مكانيكي مورد بررسي قرار گرفتند. سپس در اين هيدروژل¬ها، پس از ساخت و با روش غوطه¬ور شدن، مقدار 260 ميكروگرم آنزيم AmSOD1 بارگذاري شد. براي بررسي رهايش نيز از روش رهايش بر اساس انتشار استفاده شد. نتايج رهايش نشان دادند كه حداكثر 160 ميكروگرم برميلي¬ليتر پروتئين از اين هيدروژل رها شده است. اين رهايش، از مدل رهايش در طول زمان بوده و در پژوهش¬هاي مشابه بر اين مدل هيدروژل نيز تكرار شده است. با توجه به نتايج به¬دست آمده در اين پژوهش، مشخص شد كه آنزيم¬هاي AmSOD براي سلول¬ها سمي نبوده و قادر به كنترل استرس اكسيداتيو ناشي از توليد راديكال سوپراكسيد مي¬باشند. همچنين، هيدروژل ساخته شده از دو پليمر PVA و كيتوسان توانايي جذب و رهايش مقدار مناسبي از اين پروتئين را داشته و به عنوان يك پايه هيدروژل براي توسعه سازه¬هاي تحويل دارو پيشرفته مناسب مي-باشد.
چكيده انگليسي :
Reactive oxygen species (ROS) constantly threaten the health of cells as a side product of the natural reactions of aerobic cells. This group of molecules, including singlet oxygen, superoxide radical, and hydrogen peroxide, are produced in different parts of the cell, mainly in the mitochondria. They have a direct effect on vital biomolecules such as proteins, nucleic acids, and membrane lipids. They endanger the health of cells, tissues, and organs. There are several diseases related to ROS, and finding new treatment approaches for them is still the subject of much research. Among these diseases, Alzheimer's, neurodegenerative diseases, and chronic wounds are more Important. In aerobic cells, natural antioxidant systems, including enzymatic and non-enzymatic antioxidants, have been developed, which guarantee cell health by controlling ROS levels. Among these molecules, superoxide dismutase enzymes are the most critical enzymatic antioxidants, which effectively remove superoxide radicals in the cell. In this research, recombinant Avicennia marina SODs were used. These enzymes were AmSOD1(CuZnSOD) and AmSOD2(MnSOD). These two enzymes have higher activity and stability compared to other existing SOD enzymes, and they seem to be suitable options for the treatment of diseases based on the increase of excessive ROS. These two enzymes were expressed in E.coli bacteria with Rosetta (DE3) expression host. Then they were purified and dialyzed, and finally, their activity was determined. These enzymes were added to the mouse fibroblast cell line named NIH3T3 without oxidative stress to assess the effect of each enzyme on the proliferation of these cells. Oxidative stress was induced in the cell line due to the production of superoxide radicals by the reaction of hypoxanthine and xanthine oxidase, and five micrograms of AmSOD1 and 25 micrograms of AmSOD2 were added to the fibroblast cell line. The results of these experiments showed that the addition of recombinant SOD enzymes to the fibroblast cell line did not affect cell growth. When oxidative stress was induced, the viability of fibroblast cells decreased drastically. While adding these enzymes to the cell line, this stress was controlled, and the cells' survival returned to the normal state. After proving the medicinal properties of these enzymes, several hydrogel compositions were investigated for the development of nanostructures suitable for delivering these enzymes to chronic wounds. Combined hydrogels were made by using two polymers, PVA and chitosan, in equal ratios and by using consecutive melting and freezing cycles as a crosslinking methode. The physical and mechanical properties of these hydrogels were investigated. Then, 260 micrograms of AmSOD1 were loaded into these hydrogels through immersion. The diffusion method was also used to check the release. The release results showed that a maximum of 160 micrograms per milliliter of protein was released from this hydrogel. This release is over time and has been repeated in similar studies on this hydrogel model.
