توصيفگر ها :
بيماري سوختگي هاله اي لوبيا , rep-PCR , فازئولوتوكسين , Bean halo blight , Pseudomonas savastanoi pv.phaseolicola , Xanthomonas
چكيده فارسي :
بيماري سوختگي هاله اي لوبيا (Bean halo blight) از جمله بيماري هاي شايع ارقام مختلف لوبيا در سطح جهاني است كه عامل آن يك باكتري بذرزاد به نام Pseudomonas savastanoi pv.phaseolicola (Psp). مي باشد. با كاشت بذرهاي آلوده به اين باكتري در نواحي معتدل با رطوبت بالا، علايم بيماري به صورت لكه هاي كوچك، آبسوخته و نكروز در برگ و سپس در غلاف هاي لوبيا ظاهر ميشود. طي ماه هاي اسفند تا ارديبهشت سال هاي 1398 تا 1401، در سطح غلاف هاي لوبياسبز عرضه شده از مناطق جنوبي كشور مانند بندرعباس، ميناب، كازرون و جيرفت به بازارهاي اصفهان، لكه هاي مدور آبسوخته اي مشاهده شد كه با حاشيه قهوه اي احاطه شده بودند. به منظور شناسايي عامل اين بيماري، نمونه هايي از اين غلاف هاي لوبياسبز واجد علايم، از مراكز فروش سبزي در سطح شهرهاي اصفهان و خميني شهر جمع آوري شد و از سوسپانسيون ترشحات باكتريايي لكه هاي آبسوخته هر نمونه در آب (Ooze)، روي محيط Nutrient Agar كشت شد. صرف نظر از جداسازي يك باكتري با كلني هاي زرد شفاف، برآمده و با حاشيه صاف از يك نمونه لوبيا از كازرون (B Kaz1)كه با توالي يابي نوكلئوتيدي بخشي از 16S rRNA تكثير يافته آن در واكنش PCR با جفت آغازگر عمومي شناسايي كننده پروكاريوت ها (27F/1492R)، به عنوان باكتري Xanthomonas axonopodis pv. phaseolicola شناسايي شد، در 81 مورد بررسي ديگر، بطور يكنواخت يك باكتري غالب با كلني هايي به رنگ سفيد تا كرم رنگ، دوكي شكل و با حاشيه مضرس از نمونه ها جداسازي شد. اين جدايه هاي باكتريايي بدست آمده از لوبيا اكسيداز منفي بودند، در محيط كشت King’s B و تحت نورUV با طول موج 366 نانومتر فلورسنت به رنگ آبي داشتند و در مدت كمتر از 17 ساعت در برگ توتون واكنش فوق حساسيت ايجاد كردند. جدايه هاي مزبور طي واكنش PCR با استفاده از جفت آغازگرهاي عمومي پروكاريوت ها (27F/1492R)، يك باند نوكلئوتيدي حدود bp1400 تكثير نمودند كه توالي يابي دو جدايه شاخص و همرديف سازي آنها در BLAST نشان داد كه اين جدايه ها متعلق به جنس Pseudomonas هستند. توليد تك باند حدود bp 618 جدايه ها با جفت آغازگر PA-GS-F/PA-GS-R و 1018 نوكلئوتيدي با PS-F/PS-R در واكنش PCR (جفت آغازگرهاي اختصاصي جنس سودوموناس)، تعلق اين جدايه ها به جنس Pseudomonas sp. را تاييد نمود. انگشت نگاري ژنتيكي با استفاده از آغازگرهاي BOXIR وERIC1F/ ERIC2R مشخص نمود كه پروفيل محصول PCR اين جدايه ها يكسان بوده و تفاوتي بين آنها وجود ندارد. اين شباهت جدايه ها، از نظر آزمون هاي بيوشيميايي و توانايي آنها در مصرف كربوهيدرات ها نيز تاييد گرديد. به منظور تعيين گونه عامل بيماري، جدايه هاي مزبور تحت آزمون Nested PCR با جفت آغازگرهاي شناسايي كننده خوشه ژني فازئولوتوكسين P5.1/P3.1 (مرحله اول) و P5.2/P3.2 (مرحله دوم) قرار گرفتند كه به ترتيب دو باند مورد انتظار 502 و 450 نوكلئوتيدي به دست آمد. با توالي يابي اين قطعات DNA و همرديف سازي آنها در BLAST معلوم شد كه جدايه هاي مورد بررسي بيش از 99% با جدايه هاي گزارش شده Psp مشابهت دارند. به اين ترتيب عامل بيماري آبسوختگي لكه اي لوبياهاي سبز وارداتي از مناطق جنوبي كشور به اصفهان طي بهار سال هاي 1398 تا 1401، Psp تشخيص داده شد. بررسي هاي آزمايشگاهي براي تعيين زمان ماندگاري باكتري مزبور در بذر لوبيا نشان داد كه اين باكتري قادر است حداقل به مدت چهارماه (128 روز) در جمعيتي بالا بر روي سطح بذر لوبيا باقي بماند. با در نظر گرفتن امكان بقاي طولاني مدت باكتري Psp در بذر لوبيا، پيش بيني مي شود كه در صورت تامين دماي معتدل و رطوبت زياد با بارندگي هاي بهاره، در سال هاي آتي نيز خسارت بيماري لكه هاله اي لوبيا در مناطق جنوبي كشور قابل توجه باشد.
چكيده انگليسي :
Bean halo blight disease caused by a seed-borne bacterium called Pseudomonas savastanoi pv phaseolicola (Psp) is one of the most common diseases of various bean types worldwide. By cultivating infested seeds with this bacterium in temperate areas with high humidity, the symptoms of the disease appear in the form of small, water-soaked and necrotic spots in leaves and pods of the bean plants. During the months of Esfand to Ordibehesht of the years 1398 -1401, on the surface of green bean pods supplied from the southern regions of the country such as Bandar Abbas, Minab, Kazerun and Jiroft to the markets of Esfahan, round and water-soaked spots were observed, which were surrounded by a brown margin. In order to identify the causal agent of disease, the symptomatic pods were collected from vegetable stores in Isfahan and Khomeinishahr. The bacterial suspension prepared by stream of bacterial ooze from each sample in sterile water, was cultured on nutrient agar medium. Excluding the isolation of a bacterium with yellow, raised, and smooth colonies from pod samples of Kazerun (Kaz1 B) which was identified as Xanthomonas axonopodis pv phaseolicola by nucleotide sequencing of a part of its 16S rRNA, in 81 other cases, a dominant bacterium with white to cream color, spindle shaped and irregular margins was isolated from the samples. The isolates obtained from beans were oxidase negative, blue fluorescent on King's B medium under UV light (366nm) and induced a hypersensitive reaction in tobacco leaves less than 17 hours. The isolates amplified a 1400 nucleotide band in PCR reaction using the general primers of prokaryotes (1492R/27F). Sequence analysis of the fragment amplified in two representative isolates and their alignment in BLAST showed affiliation of the isolates to the genus Pseudomonas sp. The production of a single band about 618 bp of the isolates with primer pair PA-GS-F/PA-GS-R and 1018 bp with PS-R /PS-F (Pseudomonas specific primer pairs) in the PCR reaction reconfirmed that the isolates belong to Pseudomonas sp. Genetic fingerprint, using BOXIR and ERIC2R/ERIC1F primers defined PCR product profile similarity among the isolates. This similarity of isolates was also validated by their biochemical characteristics and carbohydrates utilization ability. To identify the pathogen at the species level, the isolates were subjected to nested-PCR test with primer pairs P5.1/P3.1 (first step) and P5.2/P3.2 (second step) to detect phaseolotoxin gene cluster which are specifically responsible for phaseolotoxin biosynthesis in Psp. Two expected nucleotides bands 502bp and 450bp were seen in all isolates tested, respectively. By sequencing the DNA fragments and their aligning in BLAST, it was found that the isolates are more than 99% similar to the reported isolates of Psp. In this way, the cause of the pod water soak disease of green beans imported from the southern regions of the country to Esfahan during the spring of 1398 to 1401, was diagnosed as Psp. In vivo assessing the longevity of the representative Psp on bean seeds showed that the pathogen survive in a high population on the surface of bean seed for at least four months (128 days). Considering the capacity of long-term survival of Psp bacteria on bean seeds implies that in moderate temperature and high humidity provided by spring rains, the damage of bean halo blight disease in the southern regions of the country will be significant in the coming years.
