توصيفگر ها :
اگروباكتريوم رايزوژنز , السيتور , متيل جاسمونات , ريشه مويين , ژن PAL
چكيده فارسي :
القا و توليد ريشه مويين در زرين گياه (Dracocephalum kotschyi Boiss) به عنوان يكي از تكنيك¬هاي كشت بافتي و زيست¬محيطي جهت توليد رزمارينيك اسيد، مهم¬ترين متابويت ثانويه اين گياه كه به دليل فعاليت¬هاي آنتي¬اكسيداني و ضد سرطاني شناخته شده است، مورد بررسي قرار گرفت. به همين منظور آزمايشي در قالب طرح كاملا تصادفي در چهار تكرار به صورت كشت درون شيشه¬اي طراحي گرديد. بهترين سويه اگروباكتريوم رايزوژنز از ميان سويه¬هاي MSU، A7 و A4-N از برگ¬هاي چهار هفته¬اي زرينگياه و بهترين سن برگ جهت تلقيح با باكتري، از گياهچه¬هاي دو هفته¬اي، سه هفته¬اي و چهار هفته‌اي انتخاب شدند. مناسب¬ترين محيط كشت در مرحله هم¬كشتي و پس از هم¬كشتي به منظور القا و توليد ريشه مويين از محيط كشت¬هاي MS و MS فاقد تركيبات حاوي عناصر پرمصرف (NH4NO3، KNO3، CaCl2 و KH2PO4) و حاوي آمينواسيد ال-گلوتامين به غلظت 1/0 گرم بر ليتر در مرحله هم¬كشتي و محيط كشت¬هاي MS و MS حاوي ال-گلوتامين در مرحله پس از هم¬كشتي نيز تعيين گرديد. نتايج نشان داد، توليد ريشه مويين از اين گياه به نوع سويه، سن برگ و نوع محيط كشت بستگي دارد. در حالي كه نوع سويه وسن برگ تاثيري بر روي طول ريشه تشكيل شده ندارند. بيش¬ترين درصد ريشه¬زايي به هنگام استفاده از سويه MSU (%90)، برگ چهار هفته¬ايي (28/82 درصد) و محيط كشت MS فاقد تركيبات پرمصرف و حاوي ال-گلوتامين در مرحله هم¬كشتي و محيط كشت MS حاوي ال-گلوتامين در مرحله پس از هم¬كشتي (78/75 درصد) مشاهده شد. تراريختگي ريشه¬هاي مويين تشكيل شده نيز از طريق واكنش زنجيره¬اي پلي¬مراز و به وسيله آغازگرهاي ژن¬هاي rolC، virD و aux1 تاييد شد. در اين پژوهش جهت افزايش توليد رزمارينيك اسيد، لاين¬هاي ريشه مويين زرين گياه تحت تيمار 100 ميكرومولار متيل جاسمونات در مدت زمان 48 ساعت قرار گرفت. مقدار رزمارينيك اسيد در هر يك از لاين¬ها نسبت به لاين شاهد بعد از گذشت 48 ساعت به صورت معني-داري افزايش يافت، به طوري كه در لاين L7 مقدار آن 28/6 برابر لاين شاهد گزارش شد. بررسي بيان ژن PAL در هر يك از لاين¬هاي ريشه مويين بعد از گذشت 6، 12، 24 و 48 ساعت از افزودن السيتور نشان داد كه بيان اين ژن بعد از گذشت 6 و 12 ساعت به صورت معني¬داري افزايش پيدا كرد. بيش¬ترين تاثير اليسيتور متيل جاسمونات بر روي بيان ژن PAL در هر يك از لاين¬ها بعد از گذشت 12 ساعت مشاهده شد، به طوري كه در لاين L7 مقدار آن، 63/20 برابر نسبت به لاين كنترل افزايش يافت. استفاده از كشت ريشه مويين زرين گياه و القاي ريشه¬هاي مويين با اليسيتور متيل جاسمونات در افزايش توليد رزمارينيك اسيد و بيان يكي از ژن¬هاي كليدي مسير بيوسنتزي آن موثر بوده است.
چكيده انگليسي :
Hairy root induction and production in Dracocephalum kotschyi Boiss was investigated as an environmental and a tissue culture technique for producing rosmarinic acid, the most important plant secondary metabolite well-known for its antioxidant and anticancer activities. For this purpose, an in vitro experiment was carried out in the form of a completely randomized design (CRD) with four replicates. The best strain of Agrobacterium rhizogenes among MSU, A7 and A4-N strains form four-week-old leaves of D. kotschyi and the best age of leaves for inoculation with A. rhizogenes from two, three and four-week-old seedlings were chosen. The most appropriate culture medium in the co-cultivation and after co-cultivation phases in order to induce and produce hairy roots from MS and MS culture media without macro elements (NH4NO3, KNO3, CaCl2 and KH2PO4) and containing the amino acid L- Glutamine (0.1 g/L) was determined in the co-cultivation stage, and MS and MS culture medium containing L-glutamine was also determined in the post-co-cultivation stage. The results of this experiment reported that hairy root production in D.kotschyi depended on the type of A. rhizogenes strain, the age of explant and MS medium. Nevertheless, length of produced hairy root in D.kotschyi did not depend on the type of A.rhizogenes strain and the age of explant. The highest percent of transgenic hairy root was detected in MSU strain (90%), four-week old leaf explants of D. kotschyi seedlings (82.28%) and MS medium without macro elements and containing L-glutamine in the co-cultivation stage, and MS medium containing L-glutamine in the post-co-cultivation stage (75.78%). PCR analysis was also verified the transgenic nature of the hairy roots using rolC, aux1 and virD specific primers. In this research, in order to increase the production of rosmarinic acid, the D. kotschyi hairy root lines were treated with 100 µM methyl jasmonate for 48 hours. The amount of rosmarinic acid in each of the lines increased significantly compared to the control line after 48 hours, so that in L7 line, its amount was 6.28 times that of the control line. PAL gene expression analysis in each of the hairy root lines after 6, 12, 24 and 48 hours of adding elicitor showed that the expression of this gene increased significantly after 6 and 12 hours. The highest effect of methyl jasmonate elicitor on PAL gene expression was observed in each of the lines after 12 hours, so that in L7 line, its increased 20.63 times compared to the control line. The use of D. kotschyi hairy root culture and induction of hairy roots with methyl jasmonate elicitor has been effective in increasing the production of rosmarinic acid and the expression of one of the key genes of its biosynthetic pathway.
