توصيفگر ها :
گال طوقه , درختان ميوه ي هسته دار , Agrobacterium , ژنوموار , كنترل بيولوژيكي
چكيده فارسي :
بيماري گال طوقه يكي از بيماري هاي مهم نهال هاي درختان ميوه مي¬باشد كه توسط گونه هايي از باكتري Agrobacterium spp. متعلق به خانواده ي Rhizobiaceae ايجاد مي¬شود. عامل بيماري در خاك زمستان گذراني مي¬كند و و پس از ورود به گياه از طريق زخم، با القاي رشد خارج از كنترل سلول¬هاي ميزبان (Neoplasia) موجب تشكيل گال در سطح ريشه، طوقه و شاخه¬ها مي¬شود. اين گال¬ها كه ابتدا كوچك، نرم و سفيد هستند، با گذشت زمان بزرگ¬تر، چين خورده و قهوه¬اي رنگ مي¬شوند. با توسعه گال و ايجاد فشار بر سيستم آوندي، انتقال آب و مواد غذايي در گياه كند شده وگياهان مبتلا به گال ضعيف و كم رشد مي¬مانند و ممكن است طي يك مدت طولاني از بين بروند. در كنترل بيولوژيكي بيماري گال طوقه، استفاده از باكتري A. radiobacter K1026 مرسوم است. اين باكتري، باكتريوسيني تحت عنوان اگروسين84 توليد مي-كند كه در كنترل اگروباكتريوم¬هاي نوپالين¬دار موثر است. طي سال¬هاي 1399 تا 1400 در نهالستاني در مباركه اصفهان، براي اولين بار علائم گال طوقه روي بعضي نهال¬هاي هسته¬داران مشاهده شد. به دليل اهميت وقوع بيماري و امكان انتشار بعدي آن به مناطق ديگر از طريق صادرات نهال، اهداف پژوهش حاضر شناسايي باكتري عامل بيماري و تعيين جايگاه تاكسونوميكي آن و همچنين امكان كنترل بيولوژيكي عامل بيماري توسط استرين K1026 تعيين شد. ابتدا از گال¬هاي نه نهال بادام، گوجه سبز و آلوي مبتلا به بيماري و خاك اطراف آن¬ها نمون¬ه برداري شد. پس از جداسازي باكتري از گال و خاك، تمام جدايه¬ها تحت واكنش PCR با جفت آغازگر RGF/RGR،كه در اين پژوهش بر مبناي توالي ژن fliG جنس اگروباكتريوم طراحي شده بود، يك باند حدود 517 نوكلئوتيدي تكثير كردند و به اين ترتيب تمام جدايه¬ها متعلق به Agrobacterium ارزيابي شدند. در انگشت نگاري ژنتيكي با آغازگرهاي BOX1R و ERIC1/ERIC2، جدايه¬هاي به دست آمده از گال در گروه متفاوتي از جدايه¬هاي خاك قرار گرفتند. جدايه¬هاي گال نهال¬ها درگياهان شمعداني، گوجه فرنگي، فلفل و نيز برش¬هاي هويج بيماريزا بودند، ولي جدايه¬هاي خاك غير بيماريزا تشخيص داده شدند. با استفاده از آزمون¬هاي بيوشيميايي، تعلق تمام اين جدايه¬ها به A. tumefaciens biovar1 تأييد شد. در مطالعات مولكولي، با كاربرد جفت آغازگرهاي طراحي شده از توالي نواحي ژني دخيل در بيماريزايي مانند VCF/VCR، ʹVirD2A/VieD2C و tms2A/tms2B طي واكنش PCR، در اين جدايه¬ها تك باندهاي نوكلئوتيدي با اندازه¬هاي مورد انتظار تكثير شد، ولي جدايه¬هاي خاك چنين باندهايي توليد نكردند و به اين ترتيب، بيماريزايي جدايه¬هاي گال و عدم بيماريزايي جدايه¬هاي خاك اثبات گرديد. همچنين، تكثير قطعات 206 و 246 نوكلئوتيدي در واكنش PCR، به ترتيب با جفت آغازگرهاي RBF/RBR و F14/F44 مشخص نمود كه جدايه¬هاي بيماريزاي اين پژوهش نوپالين¬دار هستند. اگرچه كاربرد جفت آغازگرهاي توصيه شده براي تعيين نوع ژنوموار موفقيت آميز نبود، ولي با ترسيم درخت فيلوژني بر اساس جفت آغازگرهاي مبتني بر ژن¬هاي housekeeping، معلوم شد كه جدايه¬هاي اگروباكتريومي از نهال، به ژنوموار1 (A. fabacearum) و جدايه¬هاي خاك به ژنوموار2 [A. (Rhizobium) pusense] شباهت دارند. براي بررسي امكان كنترل بيولوژيكي جدايه¬هاي بيماريزاي اين پژوهش با استرين K1026، طي تلقيح همزمان و يا تلقيح اوليه با K1026 و پس از 48 ساعت با جدايه¬ي بيماريزا روي محيط كشت و ديسك¬هاي هويج (in vitro) و گياهان گوجه فرنگي و فلفل درگلخانه (in vivo) ، نتايج مناسبي به دست نيامد. ظهور هاله¬ي شفاف ممانعت از رشد جدايه¬هاي بيماريزا در اطراف محل تلقيح استرين K1026 در 24 ساعت اوليه، رشد باكتري در همان ناحيه پس از 48 ساعت و شفاف شدن مجدد در پنج روز بعدي موجب ترديد در موفقيت اين كنترل بيولوژيكي شد. در آزمايشات مكرر گلخانه¬اي نيز در محل تلقيح گياهان گال تشكيل گرديد و به اين ترتيب كنترل با موفقيت همراه نبود. به منظور بررسي امكان شناسايي استرين¬هاي توليد كننده¬ي اگروسين در جدايه¬هاي بدست آمده از خاك، از توالي ژن agnF مستقر در پلاسميد pAgK84 باكتري A. radiobacter K1026 دو جفت آغازگر طراحي گرديد كه در آزمون PCR، باندهاي مورد انتظار در آن¬ها و همچنين استرين K1026 تكثير نيافت و هدف مورد نظر محقق نشد. به نظر مي¬رسد امكان كنترل بيولوژيكي گال طوقه در نهال¬هاي هسته¬دار و همچنين طراحي آغازگر براي شناسايي استرين¬هاي توليد كننده اگروسين به بررسي¬هاي بيشتري نياز دارد.
چكيده انگليسي :
Crown gall disease is one of the important diseases of fruit tree seedlings caused by Agrobacterium spp. which belong to the Rhizobiaceae family. The causative agent of the disease can overwinter in the soil and after entry into the plant tissues through the wounds, induces the out-of-control growth of host cells (Neoplasia), which lead to the formation of galls on the surface of the root, crown and branches. These galls, which are small, soft and white at first, become bigger, wrinkled and brown over time. With the development of gall and putting pressure on the vascular system, the transfer of water and nutrients in the plant is slowed down. A. radiobacter K1026 is used customary for biological control of crown gall disease which produces a bacteriocin called agrocin84, effectively controlling nopaline-type agrobacteria. From 1399 to 1400, in a nursery in Mobarakeh, Isfahan, symptoms of crown gall were observed on some stone fruits seedlings for the first time. First, the galls of nine infected almond, plum and greengage seedlings and the soil around them were sampled. After isolating the bacteria from gall and soil samples, the isolates amplified a band of about 517 nucleotides under the PCR reaction with the universal primer pair RGF/RGR, which was designed in this study based on the sequence of the fliG gene of the genus Agrobacterium. Thus, all the isolates confirmed as belonging to Agrobacterium spp. The gall isolates were able to induce gall formation on the stems of geranium, tomato, pepper and also carrot slices, but soil isolates were found to be non-pathogenic. By using biochemical tests, all these isolates were identified as A. tumefaciens biovar1. In PCR reactions, using primer pairs designed from the sequence of gene regions involved in pathogenicity including VCF/VCR, VirD2A/VirD2Cʹ and tms2A/tms2B, unique nucleotide bands with the expected sizes were amplified from DNA extracts of the gall isolates; while, soil isolates did not produce such bands confirming the pathogenic potential of gall isolates and non-pathogenicity of the soil isolates. Furthermore, the amplification of 206 and 246 nucleotide fragments in the PCR reaction with RBF/RBR and F14/F44 primer pairs, respectively, determined that the pathogenic isolates of this study are nopaline type. By drawing a phylogeny tree with primer pairs designed based on housekeeping genes, it was found that Agrobacterium isolates from seedlings are similar to genomovar1 (A. fabacearum) and soil isolates are similar to genomovar2[A. (Rhizobium) pusense] . During investigating the possibility of biological control of the pathogenic isolates with K1026, the results were not reasonable after a great effort for simultaneous inoculation of the pathogen and K1026 or primary inoculation with K1026 and 48 hours later the pathogenic agrobacterium, on the culture media and carrot discs (in vitro) and tomato and pepper in the greenhouse (in vivo). On the culture medium, a clear halo preventing the growth of pathogenic isolates around the inoculation site of strain K1026 was appeared in the first 24 hours, however the subsequent grow back of bacteria on the same area after 48 hours and becoming clear again in the next five days raised doubts about the success of this biological control. In repeated experiments in the greenhouse, gall was formed at the inoculation site, and thus the control was not successful. To investigate the possibility of identifying agroin-producing strains in isolates obtained from soil, two pairs of primers were designed from the agnF gene sequence located in the pAgK84 plasmid of A. radiobacter K1026. In the PCR test, the expected bands were not amplified in them, nor the K1026 strain and the desired goal was not achieved. It seems that possibility of biological control of crown gall in seedlings and also primer design to identify agrocin-producing strains needs more investigations.
