توصيفگر ها :
آنزيم آنتي اكسيدان , كاتالاز , مقاومت , گونه‌هاي فعال اكسيژن , تنش
چكيده فارسي :
كاتالاز (CAT) يك آنزيم مهاركننده كليدي براي تجزيه هيدروژن پراكسيد (H2O2) است كه نقش مهمي در تحمل به تنش‌هاي غيرزيستي مختلف در بسياري از موجودات زنده دارد. كاتالازها در صنايع غذايي، پزشكي، دارويي، كاغذ، صنعت نساجي و همچنين زيست پالايي استفاده مي¬شود. گياه حرا (Avicennia marina ) سازگاري منحصر به فردي براي مقابله با شرايط تنش محيطي مانند شوري زياد، دماي بالا، موادغذايي كم و تشعشعات بيش از حد دارد و داراي مكانيسم¬هاي سلولي متفاوتي براي حفظ غلظت صحيح يون¬هاي فلزي ضروري در قسمت¬هاي مختلف سلولي مي¬باشدكه به سبب سيستم آنتي¬اكسيداني قوي در به حداقل رساندن آسيب ناشي از قرار گرفتن در معرض غلظت¬هاي سمي فلزات ضروري و غيرضروري نقش مهمي دارد. در اين مطالعه به منظور مشخصه¬يابي آنزيم كاتالاز در گياه حرا ژن كد كننده اين آنزيم در پلاسميد pET32a همسانه¬سازي شد و سپس با انتقال به سويه Rosetta (DE3) نوتركيب R-AmCAT ايجاد و با القاي باكتري توسط ايزوپروپيل بتا-دي-1-تيوگالاكتوپيرانوزيد(IPTG) بيان پروتئين در باكتري القا شد. با تخريب سلول با استفاده از روش شوينده سديم دودسيل سولفات (SDS) و روش ليز آنزيمي پروتئين¬هاي كل و محلول باكتري به ترتيب استخراج شدند. فعايت آنزيمي كاتالاز نوتركيب Trx-AmCAT به روش مبتني بر اكسيداسيون يك الكل مانند متانول به فرمالدئيد در حضور هيدروژن پراكسيد سنجيده شد. همچنين در اين تحقيق، اثر غلظت¬هاي مختلف هيدروژن پراكسيد، نمك كلريد سديم، بوتانول، اتانول، سوربيتول، دما و فلزات سنگيني مانند كادميوم و سرب بر روند رشد سويه تراريخت AmCAT و تحمل اين سويه در برابر اين تنش¬ها مورد بررسي قرار گرفت. نتايج نشان داد كه AmCAT به صورت فيوژن پروتئين Trx-AmCAT با مقدار بيشتر در فاز نامحلول و با مقدار كمتر در فاز محول توليد ¬شد و تغيير ميزان IPTG و كاهش دما تاثير زيادي بر روي افزايش حلاليت پروتئين ندارد. پروتئين استخراج شده از باكتري R-AmCAT فعاليت آنزيمي در حدود 89/14 واحد بر ميلي گرم بر اساس متد اكسيداسيون الكل و1200 واحد بر ميلي گرم بر اساس كاهش ميزان هيدروژن پراكسيد نشان داد. اين مقدار براي كاتالاز در سويه شاهد به ميزان دو برابر كاهش داشت. در مقايسه اين كاتالاز با كاتالاز كبد گاو به ميزان 5/3 برابر كمتر بود و در مقايسه با كاتالاز در ديگر گياهان از سطح فعاليت خوبي برخوردار بود. بيان دگرساخت AmCAT، نقش مهمي در تحمل باكتري به استرس غيرزيستي مانند هيدروژن پراكسيد، نمك كلريد سديم، بوتانول، اتانول، دما و فلز سرب دارد.
چكيده انگليسي :
Catalase (CAT) as a key inhibitory enzyme for the decomposition of hydrogen peroxide (H2O2) and plays an important role in tolerance to various abiotic stresses in many different organisms. Catalases are used in food, medicine, pharmaceuticals, paper, textile industry, and also in bioremediation. Mangrove plants (Avicennia marina) have a unique adaptation to deal with environmental stress conditions such as high salinity, high temperature, low nutrients, and excessive radiation, and have different cellular mechanisms to maintain the correct concentration of essential metal ions in different parts of the cell. It is necessary to minimize the damage caused by exposure to toxic concentrations of metals, there are it has a strong antioxidant system. In this study, in order to characterize the catalase enzyme in mangroves, the gene encoding this enzyme was homogenized in plasmid pET32a, and then the R-AmCAT recombinant strain was created by transferring it to the Rosetta strain (DE3). By Isopropyl β-D-Thiogalactopyranoside (IPTG), protein expression was induced in the bacteria. Total proteins and bacterial solution were extracted by cell destruction using the detergent (SDS) method and enzymatic lysis method. The enzyme activity of the recombinant catalase Trx-AmCAT was measured by the method based on the oxidation of an alcohol, such as methanol to formaldehyde in the presence of hydrogen peroxide. Also, in this research, the effect of different concentrations of hydrogen peroxide, sodium chloride salt, butanol, ethanol, sorbitol, temperature, and heavy metals such as cadmium and lead on the growth process of the AmCAT recombinant strain and the tolerance of this strain against these stresses were investigated. The results show that AmCAT is produced in the form of the Trx-AmCAT protein fusion with a higher amount in the insoluble phase and a lower amount in the solution phase. Changing the amount of IPTG and reducing the temperature did not show a significant effect on imcreamental protein solubility. The protein extracted from R-AmCAT bacteria showed an enzyme activity of about 14.89 units/mg based on the alcohol oxidation method and 1200 units/mg based on the reduction of hydrogen peroxide. This value for catalase in the control strain was reduced by 2 times. Compared to Bovine liver catalase, it was 3.5 times lower, and compared to catalase in other plants, it had a good level of activity. The recombinant expression of AmCAT plays an important role in bacterial tolerance to abiotic stress such as hydrogen peroxide, sodium chloride salt, butanol, ethanol, temperature, and lead metal.
