چكيده فارسي :
آرسنيك يكي از سميترين عناصر جهان محسوب ميشود. با اين حال امروزه در زنجيرهي غذايي انسانها و جانوران نفوذ كردهاستوخطراتجبرانناپذيريبرايسلامتآنهاپديدآوردهاست. شناساييكلاتهكنندههايپروتئينيياغيرپروتئيني در موجودات از اهميت زيادي برخوردار است. ميكروارگانيسمها استراتژيهاي مختلفي براي مقابله با آرسنيك ايجاد كردهاند. وجود اپرون ars پلاسميدي و كروموزومي يكي از مهمترين مكانيسمها براي سمزدايي آرسنيك در باكتريها است. ArsR يك پروتئين تنظيم كننده است و به عنوان بازدارنده اپرون ars عمل ميكند، بهعلاوه اين پروتئين قابليت اتصال به آرسنيت را نيز دارا ميباشد كه ميتوان با بيشبيان اين پروتئين ميزان جذب آرسنيك توسط باكتري را افزايش داد. در اين تحقيق مهندسي ژنتيك باكتري سودوموناس پوتيدا سويه غير بيماري زا KT2440 به منظور افزايش تجمع آرسنيك در اين باكتري استفاده شد. دليل استفاده از اين باكتري ساپروفيت بودن و در نتيجه امكان زيست آن در زيستگاههاي اكولوژيكي مختلف مانند خاك، زهكشها، آب شيرين و شور مي باشد. اين خصوصيات باعث شد كه به جاي استفاده از باكتري اشريشياكلي از اين باكتري استفاده گردد. لذا ژن كد كننده cgArsR از باكتري كورينه باكتريوم گلوتاميكوم كه قبلا جداسازي شده بود به وكتور بياني مناسب براي سودوموناس پوتيدا يعني پلاسميدpSEVA234 انتقال يابد. براي ساخت اين دستواره از باكتري اشريشاكلي به عنوان ميزبان اول استفاده شد. پس از ساخت دستواره نهايي به سودوموناس پوتيدا انتقال داده شد. پس از القا با IPTG بيان شكل نوتركيب اين دو پروتئين مورد بررسي قرار گرفت. به اين منظور پروتئين كل با استفاده از SDS و پروتئين فاز محلول با استفاده از ليز آنزيمي استخراج شد و بر روي SDS-PAGE ران شدند. باند پروتئين
با وزن مولكولي منطبق بر CgArsR بر روي ژل مشاهده شد كه نشان دهنده بيان موفق شكل نوتركيب اين پروتئينها بود. پس از تأييد بيان پروتئين در فاز محلول و افزايش مقاومت سويه مهندسي شده در برابر 4 ميليمولار آرسنيت، تجمع زيستي +As3 متصل به پروتئين ArsR در سلولهاي در حال استراحت در غلظتها و زمانهاي مختلف، pH و غلظتهاي مختلف
NaCl مورد بررسي قرار گرفت. انتخاب سلولهاي در حال استراحت به اين دليل بود كه در اين حالت، سلول نياز به مواد مغذيبرايرشدنداردوفقطازنظرمتابوليكيفعالاست. نتايجنشاندادكهباكتريمهندسيشدهعملكردبهتريدرحذف آرسنيك نسبت به سويه شاهد داشت. به طوريكه در غلظت 0/5 ميليمولار آرسنيك در بافر فسفات با pH 7.4 و غلظت صفر NaCl و در زمان ده ساعت، 264/6 ميكروگرم آرسنيت به ازاي هر گرم وزن خشك سلول حذف شد، اين درحالياست كه در سويهي شاهد اين مقدار 136/9 ميكروگرم آرسنيت بر گرم وزن خشك باكتري بود. همچنين با افزايش و ياكاهش غلظت اوليهي آرسنيك ميزان تجمع كاهش يافت درواقع بهترين عملكرد باكتري تا جايي است كه بقاي باكتري تهديد نشود و فعاليت پمپهاي خروج آرسنيك كمتر از عوامل ورود آرسنيك (مانند پروتئين ArsR) به درون سلول باشند. همچنين به منظور اندازهگيري ميزان تجمع آرسنيك در شرايط محيطي مختلف، اين آزمايش در غلظتهاي مختلف NaCl و pH متفاوت انجام شد. باوجود اختلاف بين دو سويهي كنترل و P .ArsR اما بهترين نتيجه در 7 pH و غلظت صفر NaCl مشاهده شد. بالا رفتن تجمع آرسنيك در سودوموناس پوتيدا براي در اين تحقيق و قابليت آن در استفاده براي حذف آرسنيك در
حالت استراحت چشم انداز جديدي را براي استفاده از اين باكتري براي زيست پالايي ايجاد مي كند.
چكيده انگليسي :
Arsenic contamination, caused by industrial activities and disruption of its natural cycle, has become a global problem. This leads to groundwater pollution and arsenic accumulation in edible plants, entering the food chain. Microorganisms have evolved diverse resistance mechanisms to cope with arsenic toxicity. One of the most important mechanisms in bacteria is the reduction of arsenate to arsenite and its pumping out of the cell, controlled by the ars operon and its regulatory protein, ArsR.Inspired by this bacterial resistance mechanism, this study genetically engineered Pseudomonas putida by transferring the ArsR1 gene from Corynebacterium glutamicum. P.putida is a safe host for genetic manipulation.After protein expression in the soluble phase and increased resistance of the GMO strain to 4 mM arsenite, the bioaccumulation of protein-bound As3+ in resting cells was investigated at different concentrations and times, pH, and NaCl concentrations. Resting cells were chosen because in this state, the cell does not need nutrients for growth and is only metabolically active. The results showed that the modified bacterium had better arsenic removal performance. In 0.5 mM arsenic in phosphate buffer at pH 7.4 and 0 NaCl concentration, 264.6 μg arsenite per gram dry cell weight was removed after 10 hours, while in the wild-type strain this value was 136.9 μg arsenite per gram dry cell weight. In fact, the best performance of the bacterium is up to the point where bacterial survival is not threatened and the activity of arsenic efflux pumps is less than the factors that allow arsenic entry (such as the ArsR protein) into the cell.Therefore, the potential application of biotechnology and gene transfer to resting bacteria in the field of bioremediation of arsenic-contaminated water and soil was investigated in this study.
