پديد آورنده :
سليماني فرد، ايمان
عنوان :
بيان هترولوگ، خالص سازي و بررسي قابليت اتصال به فلز يكي از ايزوفروم هاي تيپ 3 متالوتيونين برنج (Oryza sativa)
مقطع تحصيلي :
كارشناسي ارشد
گرايش تحصيلي :
بيوتكنولوژي
محل تحصيل :
اصفهان: دانشگاه صنعتي اصفهان، دانشكده كشاورزي
صفحه شمار :
چهارده،78ص.: مصور،جدول،نمودار
يادداشت :
ص.ع.به فارسي و انگليسي
استاد راهنما :
آذرشاه پيري
استاد مشاور :
آقا فخرميرلوحي
توصيفگر ها :
فلزات سنگين , پروتئين نوتركيب , همسانه سازي ژن
تاريخ نمايه سازي :
2/2/93
استاد داور :
مسعود بهار، امير مساح
چكيده فارسي :
چکیده در سالهاي اخیر افزایش ورود آالیندهاي زیستی به اکوسیستمهاي طبیعی تبدیل به یکی از مهمترین چالشهاي زندگی روزمره انسان شده است در این میان آلودگی با فلزات سنگین که عمدت در اثر فعالیتهاي صنعتی ایجاد میگردد بدلیل ویژگی تجزیه ا ناپذیري زیستی و شیمیایی از خطرناکترین آلودهکنندهها بشمار میآید در سلولهاي موجودات زنده بمنظور کاهش اثرات سمیت فلزات مکانیسمهایی تعبیه شده است که از جمله آن میتوان پروتئینهایی با خاصیت تمایل زیاد به کالته کردن فلز را نام برد متالوتیونینها MTs گروهی از پروتیین هاي با وزن ملکولی پایین و سرشار از اسید آمینه سیستیین هستند که بواسطه دارا بودن گروه تیول توانایی پیوند با فلزات مختلف را دارند متالوتیونین هاي گیاهی مطابق طبقه بندي انجام شده بر پایه الگوي پراکنش اسیدآمینه سیستئین در چهار تیپ تقسیم بندي شدهاند تاکنون پژوهشها در رابطه با متالوتیونین بیشتر بر روي آنالیز بیان آنها در بافتهاي مختلف با استفاده از روش RT PCR متمرکز شده و کمتر به نقش اختصاصی ایزوفرمهاي مختلف در سطح پروتئین پرداختهاند این تحقیق بمنظور بررسی نقش پروتئین OsMTI 3a که یکی از ایزوفرمهاي تیپ9 برنج میباشد در ایجاد تحمل به تنش فلزات سنگین و قابلیت اتصال به فلز این ایزوفرم انجام گردید بدین منظور با طراحی آغازگرهاي اختصاصی توالی ژن کد کننده این پروتئین در جایگاه برشی 1 EcoR و Hind در پایین دست پروموتر7 T همسانهسازي و سپس به سویه بیانی 3 Rosetta DE منتقل گردید با القاي بیان توسط IPTG تولید مقیاس وسیع سویه شاهد Rosetta pET41a وسویه نوترکیب Rosetta pET 41a OsMTI 3a میسر گشت با رسم منحنیهاي رشد درحضور نمکهاي کلرید کادمیوم سولفات منیزیم سولفات روي و کلرید نیکل تحمل باکتري سویه نوترکیب به فلزات بررسی گردید همچنین با اندازهگیري مقدار فلزات در محیط کشت توسط دستگاه طیف سنجی جذب اتمی AAS به بررسی میزان حذف فلزات توسط باکتري تولید کننده پروتئین OsMTI GST OsMTI 3a پرداخته شد با استفاده از روش کروماتوگرافی جذبی خالصسازي پروتئینهاي کنترل GST و نوترکیب 3a انجام و با مقایسه آنها در محیط in vivo و شرایط in vitro توسط واکنش با ماده DTNB و همچنین تغییرات در جذب نوري تمایل و ظرفیت اتصال به فلزات پروتئین نوترکیب GST OsMTI 3a سنجیده شد نتایج حاصل از بررسی تحمل سویه نوترکیب به فلزات نشان داد پروتئین نوترکیب GST OsMTI 3a موجب افزایش تحمل سلولهاي باکتري Rosetta pET 41a OsMTI 3a به Rosetta pET 41a فلزات نیکل کادمیوم و روي شد در حالیکه تولید این پروتئین موجب افزایش تحمل سلولهاي باکتري OsMTI 3a به فلز مس نگردید از واکنش DTNB با پروتئینهاي نوترکیب تولید شده در محیط in vivo و شرایط in vitro مشخص شد تمایل پروتئین GST OsMTI 3a به فلزات بررسی شده بترتیب بصورت Cd Ni Zn Cu میباشد اندازه گیري و GST OsMTI 3a مقایسه میزان فلز در فاز محیط کشت سویههاي شاهد و نوترکیب با دستگاه AAS نشان داد پروتئین نوترکیب موجب کاهش فلزات کادمیوم نیکل و روي بترتیب بهمیزان 1 12 6 12 و 4 8 درصد از محیط کشت گردید درحالیکه در مورد فلز مس بیان این ژن کاهش قابل مالحظه اي را در حذف فلز از محیط کشت نشان نداد در نهایت با توجه به نتایج بدست آمده به نظر میرسد پروتئین OsMTI 3a قابلیت اتصال به فلزات کادمیوم نیکل و روي را دارد واژگان کلیدی متالوتیونین فلزات سنگین پروتئین نوترکیب همسانهسازی ژن
چكيده انگليسي :
85 Iman Soleimani Fard i soleymanifard@yahoo com January 11 2014 Department of Agricultural Biotechonolgy Isfahan University of Technology Isfahan 84156 83111 IranDegree M Sc Language FarsiA Shahpiri Ph D Assist Prof a shahpiri@cc iut ac irAbstractIn recent years increasing bio pollutants entering into natural ecosystems has become one of the majorchallenges of human everyday life The heavy metals caused by industrial activities mainly is considered themost dangerous polluters due to biological and chemical characteristics of inseparability In organism s cells inorder to reduce the toxic effects of metals embedded mechanisms that can include proteins with high affinityproperty to metal chelater Metallothioneins MTs are a group of low molecular weight proteins and rich inamino acid cysteine that have the ability to have binds with various metals because of thiol groups Plantmetallothioneins according to the classification done based on the distribution pattern of the amino acidcysteine were categorized in 4 type Until further research in relation to metallothioneins expression analysis indifferent tissues by RT PCR using isoform specific has focused and levels has examined less of a especial rolein protein This study has been done in order to investigate the role of OsMTI 3a protein which is one isoform oftype 3 of rice in tolerance ratio to heavy metals and metal binding ability of these isoforms was performed inorder to with designing of specific primers sequence of the gene encoding of this protein in shear positionEcoR1 and Hind in downstream T7 promoter was cloned and Then to expressional strain Rosetta DE3 wastransformed Production of control strain Rosetta pET41a large scale and recombinant strain Rosetta pET 41a OsMTI 3a has done by induction of expression by IPTG Recombinant strain of bacteria tolerant to metals wasinvestigate by Growth curves drawing in presence of cadmium chloride salts magnesium sulfate zinc sulfateand nickel chloride Furthermore removal amount of metal by bacteria producing OsMTI 3a protein has donewith measuring metal concentrations in the culture medium by atomic absorption spectroscopy AAS Usingaffinity chromatography purification of recombinant proteins and GST control GST OsMTI 3a was done andBy comparing them in conditions in vivo and in vitro by reaction with DTNB substance as well as changes inabsorbance the preoccupation and capacity bind to metal GST OsMTI 3a recombinant protein was measured The results of the evaluation of recombinant strains tolerance to metals showed that GST OsMTI 3arecombinant protein cause increasing in tolerance of bacterial cells to metals of nickel cadmium and zincbecame while the production of this protein did not cause increasing in the cell tolerance of bacterial Rosetta pET 41a OsMTI 3a to the copper metal from the DTNB reaction with recombinant proteins produced in the invivo and in vitro conditions was determined that preoccupation of the GST OsMTI 3a protein in evaluatedmetals are Cd Ni Zn Cu respectively Measurement and comparison the metal amount in the phase ofculture medium of control and recombinant strains with AAS showed that GST OsMTI 3a recombinant proteinhas caused a reduction in the metals cadmium nickel and zinc with amounts 17 2 12 6 and 8 4 of The culturemedium respectively while expression of this gene didn t show noticeable decreasing in removal of coppermetal in culture medium Finally according to the achieved results it seems that OsMTI 3a protein has theability to bind to cadmium nickel and zinc metals Keyword Gene Cloning Heavy Metals Metallothioneinen Recombinant protein
استاد راهنما :
آذرشاه پيري
استاد مشاور :
آقا فخرميرلوحي
استاد داور :
مسعود بهار، امير مساح
